渠 巍，梁 璐，文春蓉，魯衍強，湯 萍，胡季芳△，楊 琦

(1.貴陽市婦幼保健院檢驗科，貴陽 550003；2.上海張江普匯轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，上海 201210；3.中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心，北京 100081)

出生缺陷是指胎兒在出生前，在母體子宮內(nèi)便已發(fā)生了發(fā)育異常[1]，是導(dǎo)致早期流產(chǎn)、死胎，圍產(chǎn)兒、嬰幼兒死亡和殘疾的主要原因之一[2]。據(jù)統(tǒng)計，我國出生缺陷總發(fā)生率約為 5.6%，近年來，出生缺陷總發(fā)生率呈上升趨勢。出生缺陷不僅是造成兒童殘疾的重要原因，也日漸成為兒童死亡的主要原因[3]。

葉酸是人體內(nèi)重要的水溶性維生素，參與機體蛋白質(zhì)、核酸等重要成分的合成與修飾，在細胞分裂、胚胎發(fā)育中具有十分重要的作用。大量研究證實，葉酸缺乏可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管畸形、先天性唇腭裂、高同型半胱氨酸血癥，還和某些出生缺陷的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[4-5]。此外，葉酸代謝障礙也與女性胚胎停育、習(xí)慣性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等病癥相關(guān)[6-8]。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，大量國內(nèi)外研究表明，其基因多態(tài)性差別是導(dǎo)致個體葉酸代謝個體化差異的主要原因[9-13]。本研究以貴州省漢族、布依族育齡女性為研究對象，并對其民族組成進行分析，檢測受檢者MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因分型，獲取其在該地區(qū)人群的分布特征，從而為當(dāng)?shù)刂朴喨~酸個性化補服方案提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2019年1月在貴州省婦幼保健院就診的育齡女性為研究對象，其中漢族女性2 719人，平均年齡(33.0±5.7)歲；布依族女性371人，平均年齡(33.7±5.4)歲。均獲得受檢者知情同意。

1.2 研究方法 采用國家婦幼保健中心指定采樣拭采集受檢者的口腔黏膜細胞，柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取樣本DNA。Taqman-MGB探針(表1)熒光定量PCR檢測MTHFR C677T/A1298C和MTRR A66G的位點多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。相關(guān)儀器、試劑均購于美國ABI公司。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光。采用Hardy-Weinberg平衡分析MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性，利用分析軟件(ABI SDS 2.3)確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。不同地區(qū)間樣本基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用HaploView4.2軟件進行單核苷酸多態(tài)性的Hardy-Weinberg平衡分析。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析 研究對象布依族、漢族女性編碼MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的位點基因多態(tài)性均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，其中漢族：χ2分別是0.86、1.00、0.00；布依族：χ2分別是2.01、1.27、1.87(P>0.05)。

2.2 基因型和等位基因頻率分布比較

2.2.1 貴州省漢族女性和布依族女性的比較 貴州省漢族女性與布依族女性MTHFR C677T 、MTHFR A1298C位點基因型頻率和等位基因頻率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且葉酸代謝關(guān)鍵酶基因位點風(fēng)險基因型MTHFR 677CT、677TT比較中，漢族女性高于布依族女性；漢族女性MTRR A66G位點基因型頻率與等位基因頻率與布依族女性比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見表2、3。

2.2.2 貴州省漢族女性MTHFR(C677T、1298C)與MTRR(A66G)與其他地區(qū)漢族女性比較 貴州省漢族女性MTHFR C677T 位點基因型(CC、CT、TT)頻率和等位基因頻率與湖北、海南、長春、新疆、廊坊、銀川、淄博、鄭州、蘇州、眉山、湘潭、南寧、陽江等地漢族女性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中貴州漢族女性風(fēng)險基因型MTHFR 677CT、677TT頻率低于長春、新疆、廊坊、銀川、淄博、鄭州、蘇州、湖北、眉山地區(qū)漢族女性，高于湘潭、南寧、陽江、海南漢族女性，風(fēng)險基因型所占比例呈現(xiàn)北方高于南方的趨勢；當(dāng)?shù)貪h族女性MTHFR A1298C位點基因型(AA、AC、CC)頻率和等位基因頻率與長春、廊坊、淄博、鄭州、蘇州、湖北、湘潭、南寧、陽江、海南地區(qū)漢族女性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中風(fēng)險基因型MTHFR 1298AC、1298CC頻率高于長春、廊坊、淄博、鄭州、蘇州、湖北，低于湘潭、南寧、陽江、海南；MTRR A66G位點基因型(AA、AG、GG)頻率與等位基因頻率與淄博、陽江、海南漢族女性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，且風(fēng)險基因型MTRR 66AG、66GG 頻率高于淄博漢族女性，低于陽江、海南漢族女性。見表4、5。

2.2.3 貴州省布依族族女性和其他地區(qū)少數(shù)民族女性的比較 貴州省布依族女性MTHFR C677T 位點基因型頻率和等位基因頻率與延邊朝鮮族、遼源滿族、銀川回族、利川土家族、張家界土家族、思南土家族、思南苗族、大理白族、南寧壯族、柳州苗族、海南黎族比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中MTHFR 677CT、677TT基因型頻率低于延邊朝鮮族、遼源滿族、銀川回族、利川土家族、張家界土家族、思南土家族、思南苗族、大理白族，高于南寧壯族、柳州苗族、海南黎族；MTHFR A1298C位點基因型頻率與延邊朝鮮族、利川土家族、張家界土家族、大理白族、南寧壯族、海南黎族間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且MTHFR 1298AC、1298CC基因型頻率高于延邊朝鮮族、利川土家族、張家界土家族、大理白族、南寧壯族，低于海南黎族；MTHFR A1298C位點等位基因頻率與三亞黎族比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MTRR A66G位點基因型頻率與等位基因頻率與新疆維吾爾族、西藏藏族、銀川回族、海南黎族比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且貴州布依族女性MTRR 66AG、66GG 基因型頻率高于以上4個民族。見表6、7。

表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢?/p>

表2 貴州漢族與布依族女性MTHFR、MTRR基因型頻率比較[n(%)]

表3 貴州漢族與布依族女性MTHFR、MTRR等位基因頻率比較[n(%)]

表4 貴州漢族女性與其他地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR基因型頻率比較[n(%)]

續(xù)表4 貴州漢族女性與其他地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR基因型頻率比較[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)

表5 貴州漢族女性與其他地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR等位基因頻率比較[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)

表6 貴州布依族與其他地區(qū)少數(shù)民族女性MTHFR、MTRR基因型頻率比較[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)

表7 貴陽布依族與其他地區(qū)少數(shù)民族女性MTHFR、MTRR等位基因頻率比較[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)

3 討 論

MTHFR和MTRR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，而后者作為甲基傳遞的重要載體，使同型半胱氨酸生成甲硫氨酸，MTHFR 677位點C被T取代后，編碼的丙氨酸被纈氨酸代替， 導(dǎo)致酶的耐熱性和活性下降，研究發(fā)現(xiàn)與CC型酶活性相比，CT型酶活性為56%，TT 型酶活性只有22%，將嚴(yán)重影響葉酸在體內(nèi)的有效利用，增加神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂等出生缺陷的發(fā)病風(fēng)險[36]。

貴州省2010—2014年出生缺陷監(jiān)測醫(yī)院共監(jiān)測圍產(chǎn)兒557 081例，出生缺陷兒共7 232例，出生缺陷總發(fā)生率為129.82/萬[37]。葉酸增補是我國目前針對出生缺陷一級預(yù)防的主要措施之一，雖然我國在2009年實行農(nóng)村育齡女性免費增補葉酸的公衛(wèi)政策，但對神經(jīng)管畸形的預(yù)防作用在各地也存在差異。孕婦體內(nèi)葉酸水平受飲食習(xí)慣、地域、遺傳等因素的影響，對營養(yǎng)的需求因人而異，對備孕及已懷孕的女性進行葉酸利用能力的評估，有助于了解機體對葉酸的利用能力，制訂個性化的營養(yǎng)干預(yù)方案。本研究通過對貴州省育齡女性的葉酸代謝利用能力進行基因分型檢測，調(diào)查貴州省漢族女性、布依族女性的葉酸代謝關(guān)鍵酶MTHFR和MTRR基因位點多態(tài)性，該研究數(shù)據(jù)豐富了我國少數(shù)民族生物樣本信息庫，同時為后續(xù)研究營養(yǎng)、遺傳、環(huán)境對出生缺陷影響，制訂個體化的葉酸營養(yǎng)干預(yù)方案提供了分子醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。