魏 薇，劉秋子，李琛琛，應(yīng)開(kāi)承，李 靜，李長(zhǎng)林△

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，山東濟(jì)寧 272067；3.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，天津 300071)

病理性心肌肥大(PCH)心肌應(yīng)對(duì)某些刺激時(shí)所表現(xiàn)出的一種適應(yīng)性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增大。病理性心肌肥大是許多心血管疾病如高血壓、冠心病發(fā)展過(guò)程中的重要病理改變，其最終往往會(huì)導(dǎo)致心力衰竭、心律不齊，甚至猝死[1-2]。

病理性心肌肥大的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病變過(guò)程，目前關(guān)于其機(jī)制仍不是很清楚。以往研究表明，多種蛋白激酶在PCH的形成過(guò)程中扮演重要角色。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種蛋白激酶參與PCH形成過(guò)程。研究較為廣泛的有蛋白激酶C(PKC)[3]、蛋白酶激D(PKD)[4-5]、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)[6]、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)[7]。

PKD是一個(gè)色氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，有3個(gè)成員，即PKD1、PKD2和PKD3[8]。以往研究表明PKD1和PKD3在PCH的形成中發(fā)揮重要作用[4-5]。雖然關(guān)于PKD1和PKD3在參與病理性心肌肥大形成的研究比較多，但是關(guān)于PKD2是否參與心肌肥大調(diào)控缺少研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PKD2與PCH發(fā)生之間的關(guān)系，揭示PKD2在PCH形成中的作用，為干預(yù)和逆轉(zhuǎn)心肌肥大，預(yù)防和治療相關(guān)的心血管疾病提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、Trizol、α-actin和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Anti-PKD2抗體購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogene公司。HRP-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 和山羊抗兔IgG購(gòu)于武漢三鷹公司。Trizol、AlexaFluor-488(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)519 nm，綠色)和碘化丙啶(PI，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)630 nm，紅色)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。SD成年大鼠和新生大鼠(乳鼠)，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞分離 新生大鼠和成年大鼠心肌細(xì)胞分離參照本實(shí)驗(yàn)室建立的分離方法[5]。

1.2.2 Real-time PCR分析 用Trizol裂解心肌細(xì)胞提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)形成cDNA進(jìn)行RT-PCR和Real-time PCR分析。RT-PCR引物為：PKD2：正向5′-ATC ACC GCC AAT GT CAC CTA CT-3′，反向5′-GTT TCT CCA TCA CCA CGA ATA CC-3′；18S rRNA：正向5′-ACC GCA GCT AGG AAT AAT GGA-3′，反向5′-GCC TCA GTT CCG AAA ACC A-3′；18s rRNA作為內(nèi)參基因。Real-time引物為心房利尿因子(ANF)：正向5′-GGG GGT AGG ATT GAC AGG AT-3′，反向5′-CTC CAG GAG GGT ATT CAC CA-3′；β-肌凝蛋白重鏈(β-MHC),正向5′-CCT CGC AAT ATC AAG GGA AA-3′，反向5′-TAC AGG TGC ATC AGC TCC AG-3′[9]。

1.2.3 siRNA 干擾 針對(duì)PKD2基因設(shè)計(jì)兩個(gè)siRNA干擾位點(diǎn)，將兩個(gè)位點(diǎn)的siRNA序列混合后用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染新生大鼠細(xì)胞。siRNA PKD2的兩個(gè)位點(diǎn)序列為：5′-CCU UCC UUA UAC AUA GCU ATT-3′，5′-CGG GCU GAA UUA CCA CAA ATT -3′；對(duì)照siRNA (NC siRNA) 序列:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。

1.2.4 Western blot分析 細(xì)胞蛋白用RIPA裂解液裂解，取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后與一抗4 ℃孵育過(guò)夜。應(yīng)用過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗顯色。

1.2.5 免疫熒光 細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定5 min，0.5% triton×100穿透后血清封閉30 min，一抗孵育2 h，綠色熒光標(biāo)記的二抗孵育1 h，進(jìn)行共聚焦熒光顯微鏡分析(德國(guó)Leica公司)。應(yīng)用LSM 800 Zeiss共聚焦熒光顯微鏡照相。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ促進(jìn)心肌細(xì)胞PKD2基因和蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果表明，AngⅡ(100 nmol/L)處理新生大鼠心肌細(xì)胞48 h顯著增加PKD2表達(dá)。與之相似，AngⅡ(100 nmol/L)處理成年大鼠心肌細(xì)胞24 h顯著上調(diào)PKD2蛋白表達(dá)。Real-time PCR顯示，PKD2的mRNA水平在AngⅡ誘導(dǎo)的PCH中也顯著上調(diào)。共聚焦熒光顯微鏡分析與Western blot和Real-time PCR結(jié)果一致，AngⅡ處理顯著增加PKD2蛋白在新生和成年大鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)。見(jiàn)圖1。

A：Western blot分析；B：Real-time PCR分析；C：免疫熒光分析

圖1 PKD2在AngⅡ誘導(dǎo)的PCH中表達(dá)上調(diào)

A：降低PKD2抑制AngⅡ誘導(dǎo)ANF表達(dá)上調(diào)；B：降低PKD2抑制AngⅡ誘導(dǎo)β-MHC表達(dá)上調(diào)；C：PKD2的干擾效率

圖2降低PKD2抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大基因表達(dá)上調(diào)

A：α-actin熒光染色(×20)；B：細(xì)胞表面積分析；C:PKD2基因表達(dá)

圖3心肌細(xì)胞表面積分析

2.2 沉默PKD2可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大基因上調(diào) 經(jīng)AngⅡ處理ANF基因表達(dá)顯著上調(diào)[(4.21±0.87)倍]。通過(guò)siRNA降低PKD2表達(dá)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的ANF表達(dá)上調(diào)。與之相似，AngⅡ處理顯著上調(diào)β-MHC表達(dá)[(2.23±0.20)倍]，降低PKD2表達(dá)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的β-MHC表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖2。

2.3 降低PKD2表達(dá)阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大 AngⅡ處理顯著增大心肌細(xì)胞細(xì)胞面積，通過(guò)siRNA降低PKD2表達(dá)顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增大。Real-time PCR結(jié)果顯示siRNA顯著降低PKD2表達(dá)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

PCH發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)過(guò)度激活在PCH發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[10-13]。RAAS是一類由多種肽類激素和相應(yīng)酶組成的體液調(diào)節(jié)因子的總稱。當(dāng)受到病理刺激時(shí)，在腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、氨基肽酶A(APA)和氨基肽酶N(APN)等多個(gè)酶共同作用下，血管緊張素源轉(zhuǎn)變?yōu)锳ngⅠ、AngⅡ、AngⅢ和AngⅣ[14]。其中AngⅡ是介導(dǎo)RAAS參與PCH發(fā)生的重要效應(yīng)因子。AngⅡ可以與細(xì)胞表面受體相結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)PCH相關(guān)的基因表達(dá)，最終導(dǎo)致PCH[12]。因此研究參與AngⅡ誘發(fā)PCH過(guò)程的關(guān)鍵基因，是發(fā)掘治療PCH新靶點(diǎn)的重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，在PKD2在AngⅡ誘導(dǎo)的PCH中表達(dá)顯著上調(diào)，降低PKD2 表達(dá)可以有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的PCH標(biāo)志基因ANF和β-MHC表達(dá)上調(diào)和心肌細(xì)胞表面增大。這表明，PKD2 在AngⅡ誘導(dǎo)的PCH過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)可以降低AngⅡ誘導(dǎo)的PCH。通過(guò)小分子抑制劑或基因干預(yù)方法抑制PKD2活性有可能會(huì)成為一種治療PCH的潛在新策略。

PKD廣泛參與細(xì)胞增殖、分化等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。PKD 有3個(gè)亞型：PKD1、PKD2和PKD3[8]。PKD1和PKD3參與PCH的發(fā)生。BOSSUYT等[15]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PKD1可以使HDAC5超磷酸化，促使后者遷出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而促進(jìn)心肌肥大病程相關(guān)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致PCH。TAN等[16]報(bào)道AngⅡ可以促進(jìn)PKD1表達(dá)，介導(dǎo)PCH發(fā)生。以往研究表明，PKD3通過(guò)激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酶(CaN)，CaN促進(jìn)活化T細(xì)胞核因子(NFAT4)去磷酸化，去磷酸化NFAT4進(jìn)入細(xì)胞核增強(qiáng)PCH相關(guān)基因的表達(dá)，最終誘導(dǎo)PCH[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，PKD2參與調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)的PCH發(fā)生。這表明PKD基因3個(gè)亞型PKD1、PKD2和PKD3均在PCD的發(fā)生過(guò)程起重要調(diào)控作用。MEREDITH等[17]研究發(fā)現(xiàn)PKD1選擇性抑制劑對(duì)防止實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PCH的發(fā)生效果不理想。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能會(huì)很多，但最可能的一個(gè)原因就是單一抑制PKD1亞型時(shí)，其他兩個(gè)亞型PKD2或PKD3仍然在PCD形成過(guò)程中發(fā)揮作用，誘導(dǎo)PCD發(fā)生。因此，探索能夠同時(shí)抑制PKD1、PKD2和PKD3的小分子化合物或基因干預(yù)方式可能是基于PKD靶點(diǎn)治療PCH的新思路。

綜上所述，PKD2在AngⅡ誘導(dǎo)的PCH中發(fā)揮重要作用，抑制PKD2表達(dá)能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的PCH。