李 鵬，陳 凡，馮瑞興，王 財(cái)，劉子寧

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

對放射性心臟損傷(RIHD)在臨床上缺乏有效干預(yù)藥物。近來相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究表明[1-4]，天麻素對心肌損傷具有保護(hù)作用，本研究擬探討天麻素對RIHD的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

50只C57bL/6小鼠，4～6 周齡，體質(zhì)量為20.2±1.0 克，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(陜)2017-003]。4%的多聚甲醛液(PH0427)、蛋白酶K、二甲苯(PH18JAN014、PH18JAN008)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供；IL-6ELISA試劑盒由上海玉博生物科技有限公司提供；Caspase-3抗體、兔抗羊 IgG-HRP二抗(20180716、20180911)由南京建成生物公司提供；TUNEL試劑盒、SOD和MDA試劑盒(Lot：091518181116、102318191154、112018181204)由碧云天生物提供；天麻素注射液(04871212A)由悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模

所有小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對照組，單純照射組，照射+天麻素低、中、高劑量干預(yù)組(50、100、150mg/kg)，每組10只。除對照組外，各實(shí)驗(yàn)組小鼠用放療加速器采用18 Gy的劑量照射建立小鼠RIHD模型[5]。具體方法：小鼠在照射前3 min稱體重，用2%的水合氯醛行腹腔麻醉后置于治療床上，固定四肢，將激光燈定位于心尖搏動(dòng)部，設(shè)置大約1 cm×1 cm照射野，局部照射心臟，源皮距100 cm，劑量18 Gy，劑量率4 Gy/min，照射完成后使小鼠自然蘇醒，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.2 藥物干預(yù)

造模后對各天麻素干預(yù)組進(jìn)行藥物干預(yù)。具體方法：于照射前3 d開始，參照文獻(xiàn)方法[6-8]：各組小鼠分別按50、100、150 mg/kg的劑量每天一次于腹腔注射天麻素液，非藥物干預(yù)組小鼠于腹腔注射等體積的0.9%生理鹽水。于照射后第4周周末處死小鼠，檢測小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率和血清IL-6及caspase-3、SOD、MDA水平。

1.2.3 造模后小鼠生理情況觀察及病理切片的制備

造模結(jié)束后，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中密切觀測小鼠攝食(水)及活動(dòng)情況，每隔三日稱取小鼠體重一次并記錄。

用2%的水合氯醛采用腹腔注射的方式將小鼠麻醉后，在無菌條件下，取部分心臟組織置于PBS試管中，沖洗干凈；經(jīng)多聚甲醛液固定后行梯度脫水、二甲苯透明，包埋于石蠟中后切片(2～3μm)行HE染色。

1.2.4 血清IL-6水平檢測

采集小鼠的外周血(2mL)離心(2500r/s)5 min，分離血清，然后采用IL-6 ELISA試劑盒進(jìn)行含量測定，并嚴(yán)格依照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡率檢測

利用制作病理切片時(shí)的石蠟包塊切片(2～3μm)，按照TUNEL試劑盒的說明書進(jìn)行操作，制備好后的樣片使用顯微鏡進(jìn)行觀察，深棕色者為凋亡細(xì)胞。選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 caspase-3表達(dá)水平檢測

取適量心臟組織，加一定比例的裂解液處理后離心(3000r/s)5 min，取上清液調(diào)至等濃度，上樣，電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到膜(NC)上，封閉，結(jié)合caspase-3一抗在4 ℃下孵育過夜，洗滌后，再結(jié)合二抗后用PBS液漂洗3次，將膜固定，經(jīng)HRP-ECL發(fā)光法曝光、顯影后觀察結(jié)果，計(jì)算caspase-3水平的相對表達(dá)量。

1.2.7 心肌細(xì)胞SOD、MDA含量檢測

取適量心肌組織樣品，加入SOD、MDA樣品制備液勻漿后離心(12000g)4～5 min，取上清液待測。分別用WST-8和硫代巴比妥酸法檢測SOD、MDA含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。利用全自動(dòng)分光光度計(jì)分別于450、532 nm處檢測SOD、MDA的吸光度，依此進(jìn)行含量計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般生理情況

與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)照射后均表現(xiàn)出不同程度的攝食(水)減弱、活動(dòng)不積極現(xiàn)象，小鼠被照射區(qū)域有脫毛現(xiàn)象。經(jīng)照射后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均有不同程度下降，于后期開始慢慢恢復(fù)。表1為4周末5組小鼠的體重比較：與對照組比較，單純照射組小鼠體重明顯下降；與單純照射組比較，中、高劑量藥物干預(yù)組小鼠體重升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單純照射組比較，低劑量藥物干預(yù)組小鼠體重升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Table 1 Comparison of body weight among 5 groups of

*：P<0.01，與對照組比較；#：P>0.05，##：P<0.05，###：P<0.01，與單純照射組比較

2.2 5組小鼠心肌組織病理變化情況

圖1顯示，對照組心肌纖維排列自然、清晰，間質(zhì)無明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肌間隙無增寬，細(xì)胞無萎縮與肥大(A)；與對照組比較各實(shí)驗(yàn)組小鼠均可見不同程度的局部炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列欠規(guī)則，部分可見心肌纖維斷裂、胞漿溶解、橫紋消失等心肌損傷的表現(xiàn)，以單純照射組最重(B)；與單純照射組比較，天麻素干預(yù)可使以上心肌損傷的改變有不同程度的減輕，尤其見于中、高劑量組(D、E)。

圖15組小鼠心肌組織病理變化圖(HE，×400)

Figure1Pathological changes of myocardial tissue in5groups of mice(HE，×400)

2.3 5組小鼠血清中的IL-6的比較

表2顯示，與對照組比較，單純照射組小鼠外周血血清IL-6的水平明顯提高；與單純照射組比較，低、中、高劑量藥物干預(yù)組小鼠血清IL-6含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Table 2 Comparison of serum IL-6 in 5 groups of

*：P<0.01，與對照組比較；##：P<0.05，###：P<0.01，與單純照射組比較

2.4 5組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率的比較

表3顯示，與對照組比較，單純照射組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加；與單純照射組比較，中、高劑量藥物干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單純照射組比較，低劑量藥物干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Table 3 Comparison of apoptosis rate of myocardial cells in 5 groups of

*：P<0.01，與對照組比較；#：P>0.05，##：P<0.05，###：P<0.01，與單純照射組比較

2.5 5組小鼠的心肌細(xì)胞caspase-3水平的比較

圖2、表4顯示，與對照組比較，單純照射組小鼠心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平明顯提高；與單純照射組比較，中、高劑量藥物干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與單純照射組比較，低劑量藥物干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組 B：單純照射組 C、D、E：低、中、高劑量藥物干預(yù)組

圖25組小鼠心肌細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)圖

Figure2Expression of caspase-3in myocardial cells of5groups of mice

Table 4 Comparison of caspase-3 levels in 5 groups of

*：P<0.01，與對照組比較；#：P>0.05，##：P<0.05，###：P<0.01，與單純照射組比較

2.6 5組小鼠的心肌細(xì)胞SOD、MDA水平的比較

表5顯示，與對照組比較，單純照射組小鼠心肌細(xì)胞SOD表達(dá)水平明顯減弱，MDA水平明顯增強(qiáng)；與單純照射組比較，中、高劑量藥物干預(yù)組小鼠SOD表達(dá)水平明顯升高，MDA水平明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單純照射組比較，低劑量藥物干預(yù)組小鼠SOD、MDA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Table 5 Comparison of SOD and MDA levels in myocardial cells in 5 groups of

*：P<0.01，與對照組比較；#：P>0.05，##：P<0.05，###：P<0.01與單純照射組比較

3 討論

目前，隨著放療技術(shù)的進(jìn)步，惡性腫瘤的控制率有了大幅度的提高，放療患者生存周期得以延長，這使得早期一些無法被隨訪到的RIHD病例被報(bào)道。RIHD嚴(yán)重影響放療患者后期的生存質(zhì)量，重者可至死亡，抵消了治療的益處，因此藥物干預(yù)RIHD并發(fā)癥的發(fā)生具有很大的臨床意義。目前關(guān)于天麻素對RIHD保護(hù)作用的研究未見報(bào)道，值得我們進(jìn)一步去探討。

本研究結(jié)果顯示，天麻素可減輕小鼠心肌細(xì)胞的放射性心臟損傷，可能通過下調(diào)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低細(xì)胞凋亡及抗炎來實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。

天麻素苷作為天麻素中的重要成分，對小鼠的大腦、心臟、腎臟等重要器官的缺血損傷起到抑制作用[9]。有研究[10]顯示采用天麻素可通過降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和降低IL- 6、TNF-α的表達(dá)水平改善甲基苯丙胺依賴所致神經(jīng)功能損害。這說明了天麻素可通過抗炎性反應(yīng)起到保護(hù)作用。本研究的結(jié)果顯示經(jīng)不同劑量天麻素處理的各組小鼠的IL-6水平均有明顯降低，這說明了天麻素具有抗炎性反應(yīng)的作用。

RIHD的一個(gè)主要表現(xiàn)形式就是細(xì)胞的凋亡[11]。細(xì)胞凋亡的過程是由Caspase家族激活引發(fā)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]，Caspase-3被認(rèn)為是Caspase家族的關(guān)鍵核心酶，許多學(xué)者將其活化作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[13]。因此利用心肌組織內(nèi)caspase-3含量的高低可以很好反映RIHD的情況。本研究結(jié)果顯示，與單純對照組比較，低劑量天麻素干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著天麻素劑量的升高，中、高劑量的天麻素干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率及Caspase-3的表達(dá)水平明顯降低，對RIHD發(fā)揮保護(hù)作用。

放射線引起心臟損傷的另一個(gè)主要表現(xiàn)就是出現(xiàn)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。中醫(yī)傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，天麻素有息風(fēng)定驚、平肝益氣、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痙等作用[15]。近來研究表明其還可增加外周及冠狀動(dòng)脈血流量，減輕生物膜的脂質(zhì)過氧化對心臟起到保護(hù)作用[16]。放射線造成心臟損傷后可導(dǎo)致大量氧自由基的堆積，這些氧自由基可以引起心肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，造成心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。SOD是機(jī)體內(nèi)非常重要的自由基清除劑，MDA是自由基脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物，兩者水平的高低間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平[17]。本研究的結(jié)果同樣顯示，低劑量天麻素干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞SOD和MDA的表達(dá)較單純對照組比較差異變化雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著天麻素劑量的升高，中、高劑量的天麻素干預(yù)使小鼠心肌細(xì)胞SOD的活力明顯增強(qiáng)，MDA的表達(dá)明顯降低，從而減少放射損傷后心肌組織的氧化應(yīng)激損傷；而且在一定范圍內(nèi)天麻素劑量越高，保護(hù)作用越強(qiáng)。

綜上所述，天麻素可能通過下調(diào)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)程度、減輕細(xì)胞凋亡及抗炎等來實(shí)現(xiàn)對RIHD的保護(hù)作用；且依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為在一定范圍內(nèi)采用100 mg/kg或以上劑量干預(yù)效果更佳。但關(guān)于天麻素這一保護(hù)作用的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。