王亞峰，王愛霞，王生彪，朵德龍，嚴英俊，李 茜

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007)

甘西鼠尾草(Salvia przewalskii Maxim.SPM)是唇形科鼠尾草屬多年生植物，又名大紫丹參和甘肅丹參，以根入藥，主要分布在我國甘肅西部、四川西部、云南西北部及西藏等地，四川和云南分別將其作為秦艽和丹參的代用品使用[1-3]。HAPH是一種因高原環(huán)境缺氧，導致肺動脈壓和肺血管抵抗增加，并伴隨肺血管重構和血管平滑肌細胞增殖增加為特征的疾病，該疾病最終可發(fā)展為右心衰竭甚至引起死亡，其機制涉及多個方面，包括血管平滑肌細胞的增殖、氧化應激、炎癥反應及離子通道的改變等[4-5]。文獻報道[6]和本課題組前期所獲結果都表明SPM具有明顯抗急性缺氧的作用，但該藥是否能防治大鼠HAPH還未定論，故本課題組以大鼠mPAP及RVHI為評價指標探究了SPM對大鼠HAPH的干預作用。另外，通過測定肺組織中介導增殖和炎癥反應的相關因子(包括HIF-1α、NF-κB和MCP1mRNA)的表達水平來探究SPM發(fā)揮干預作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重120～160 g，購自西安交通大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(陜)2017-003。

1.1.2 藥品與試劑

SPM藥液制備：SPM藥材經(jīng)潔凈、干燥和粉碎等步驟后用70%的乙醇溶液超聲提??；提取液經(jīng)離心、干燥及研磨后得浸膏粉。臨用前用蒸餾水配成混懸液。

藥品和試劑：氨基甲酸乙酯(烏來糖)購自上海展云化工有限公司；肝素鈉注射液購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司；RT-PCR實驗所需試劑和引物均購自TaKaRa公司(HIF-1α上游引物序列：CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA，下游引物序列：GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA；NF-κB上游引物序列：CGACGTATTGCTGTGCCTTC，下游引物序列：TTGAGATCTGCCCAGGTGGTA；MCP1上游引物序列：CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC，下游引物序列：CAGCCGACTCATTGGGATCA)。

1.1.3 儀器與設備

MP150十六導生理信號采集系統(tǒng)購自美國BioPac公司、電子天平購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司(型號：BT 224S)、StepOnePlus Real Time PCR儀購自賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

大鼠隨機分成5組，每組14只，分別為對照組(飼養(yǎng)于青海大學醫(yī)學院，海拔2260m)和缺氧組及缺氧+SPM低、中、高劑量組(低、中、高劑量為0.5、1、2g·kg-1。缺氧組及缺氧+SPM低、中、高劑量組均飼養(yǎng)于青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院，海拔4260m)，其中低、中、高劑量分別是臨床成人常用劑量的0.5、1.0、2.0倍。大鼠在相應環(huán)境下適應性喂養(yǎng)3 d后灌胃給藥(對照組和缺氧組給予相應體質量的蒸餾水)，連續(xù)4 w，期間所有大鼠均予自由飲食(水)。

1.2.2 檢測指標

4 w后參照文獻[7]方法麻醉大鼠；測定mPAP；分離右心室(RV)、左心室(LV)和室間隔(S)并分別稱重。通過RV/(LV+S)公式計算右心室肥大指數(shù)(RVHI)。然后取相同部位肺組織置液氮保存，采用RT-PCR法檢測大鼠肺組織中的HIF-1α、NF-κB和MCP1的mRNA表達情況。

1.2.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SPM對大鼠mPAP及RVHI的影響

與對照組比較，缺氧組大鼠的mPAP和RVHI均明顯升高(P<0.05)，且大鼠mPAP均大于30 mmHg，提示大鼠HAPH模型造模成功。與缺氧組比較，SPM劑量組大鼠的mPAP和RVHI均呈劑量依賴性降低，其中除低劑量組(0.5g·kg-1)的mPAP無明顯降低(P>0.05)外，中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的mPAP及各劑量組的RVHI均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，結果見表1。

Table 1 Levels of mPAP and

#：與對照組比較P<0.05；*：與缺氧組比較P<0.05

2.2 SPM對HIF-1α、NF-κB及MCP1mRNA表達水平的影響

與對照組比較，缺氧組大鼠肺組織中HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA的表達水平均明顯升高(P<0.05)；與缺氧組比較，SPM劑量組的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA表達水平均呈劑量依賴性降低，其中除低劑量組(0.5g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達水平無明顯降低外(P>0.05)，中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達水平及各劑量組的NF-κB和MCP1 mRNA表達水平均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，結果見表2。

Table 2 HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA expression in the lung

#：與對照組比較P<0.05；*：與缺氧組比較P<0.05

3 討論

本實驗中對照組大鼠置于青海西寧(海拔約2260m)，缺氧組和缺氧+SPM劑量組均置于青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院(海拔約4260m)，每組大鼠均在相應海拔連續(xù)處理4 w。在結果測定過程中，對照組、缺氧組、缺氧+低劑量SPM組、缺氧+中劑量SPM組分別有1、2、3、4只大鼠在采用右心導管法測定平均肺動脈壓過程中因未能成功插管未得到相應數(shù)據(jù)。

根據(jù)第六屆國際高原醫(yī)學和生理學術大會頒布的青海診斷標準，mPAP>30 mmHg是診斷HAPH的臨界指標[8]。本研究結果顯示缺氧組即高原連續(xù)處理4 w大鼠的mPAP顯著高于對照組(P<0.05)，且均在30 mmHg以上，說明本實驗中大鼠HAPH模型造模成功。同時，結果顯示SPM可劑量依賴性地降低大鼠的mPAP，且中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的mPAP均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且均降至30 mmHg以下，提示SPM可預防大鼠HAPH的發(fā)生和發(fā)展。

HAPH是一種可引起肺血管收縮、重構和肺循環(huán)功能障礙的疾病，其可造成右心室壓力持續(xù)超負荷，引起進行性右心室肥大，若不能得到有效診治，最終會發(fā)展為右心衰竭而引起死亡[9]。本研究結果顯示，缺氧組和給藥組大鼠的RVHI均顯著高于對照組(P<0.05)，說明在高海拔環(huán)境下，持續(xù)的低壓低氧引起大鼠發(fā)生HAPH的同時還導致了進行性的右心室肥大，而SPM干預組的RVHI較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且降低作用具有一定的劑量依賴性，提示SPM可明顯改善大鼠HAPH誘導的右心室肥大癥狀，從而在一定程度上阻止HAPH的進一步發(fā)展。

此外，在高原環(huán)境下低氧是引起HAPH的主要因素，而HIF-1α作為調節(jié)低氧適應的重要核轉錄因子，動物實驗和臨床數(shù)據(jù)都表明其激活和過度表達是導致肺動脈高壓發(fā)病的重要分子機制[10]。本研究結果顯示，大鼠經(jīng)低氧處理4 w后，HAPH大鼠肺組織中的HIF-1α mRNA表達水平較對照組明顯升高(P<0.01)，提示HIF-1α處于一種過度激活和表達的狀態(tài)，而SPM干預組顯示出劑量依賴性地下調HIF-1α mRNA表達的作用，且中劑量組(1g·kg-1)和高劑量組(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表達水平較缺氧組明顯降低(P<0.05)，提示SPM預防大鼠HAPA的發(fā)生可能與抑制HIF-1α mRNA過度表達有關。同時NF-κB作為重要的核轉錄因子，在細胞的增殖、分化和存活等過程中發(fā)揮重要作用，并對細胞因子、趨化因子、黏附分子等起關鍵的調控作用[11-12]，各種實驗動物模型研究表明抑制NF-κB激活及其活性可明顯抑制HAPH的發(fā)展[13-14]。本研究結果顯示，缺氧組大鼠肺組織中NF-κB mRNA表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，而SPM劑量組的NF-κB mRNA表達水平均較缺氧組明顯降低(P<0.05)，且降低作用具有明顯的劑量依賴性，提示SPM亦可能通過下調NF-κB mRNA過度表達而預防大鼠發(fā)生HAPH。另外，MCP1屬于趨化因子家族，是活化和聚集單核炎癥細胞至血管內皮細胞的重要介導者[15]，研究表明，其可以趨化和活化包括單核細胞、中性粒細胞以及肥大細胞等在內的多種炎性細胞，促進細胞因子產(chǎn)生與肺血管損傷等炎癥相關的正反饋過程，從而參與肺動脈高壓的發(fā)生和發(fā)展[16]。本研究結果顯示，缺氧組大鼠肺組織中MCP1 mRNA的表達水平較對照組顯著上調(P<0.05)，而SPM組可劑量依賴性地下調這一表達，提示SPM還可通過下調HAPH大鼠肺組織中的MCP1 mRNA表達水平來減輕炎癥癥狀而預防其發(fā)生HAPH。

綜上所述，SPM對高原環(huán)境誘導的大鼠肺動脈高壓及右心室肥大具有明顯的預防和改善作用，且其發(fā)揮作用的機制可能與下調HAPH大鼠肺組織中的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA過度表達有關。結合前期SPM抗急性缺氧實驗結果及相關研究報道[17]即可發(fā)現(xiàn)，SPM在抗急慢性缺氧方面均有一定的作用，故有必要對其在防治急慢性高原病方面的作用進行挖掘性研究。同時，其發(fā)揮抗缺氧作用的確切物質基礎及作用機制尚不明確，還需進行大量的研究工作。

(致謝：感謝青海省果洛州瑪多縣人民醫(yī)院、青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心在本研究中所給予的大力支持和幫助！)