王建 胡立珍 張國(guó)翠 趙輝 陳子芳

摘要：目的 ?比較對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生長(zhǎng)（PNB/TCH）和DNA微陣列基因芯片鑒定非結(jié)核分枝桿菌（NTM）臨床分離株菌種的價(jià)值。方法 ?收集2013年1月～2018年6月我院住院患者的痰分枝桿菌培陽(yáng)分離菌2175株，分別采用PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和DNA微陣列基因芯片鑒別NTM，比較兩種方法的鑒定結(jié)果。結(jié)果 ?PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)初步鑒定NTM 93株，占4.28%，DNA微陣列基因芯片鑒定NTM 79株，占3.63%，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)初步鑒定的93株NTM中，有14例為假NTM（15.05%）;PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定NTM的陽(yáng)性檢出率低于DNA微陣列基因芯片;79株NTM中，占比前3位的依次為胞內(nèi)分枝桿菌株（37.97%）、堪薩斯分枝桿菌（21.52%）、鳥分枝桿菌（16.46%）。結(jié)論 ?傳統(tǒng)對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定NTM特異性較低，采用DNA微陣列基因芯片技術(shù)鑒定NTM準(zhǔn)確，臨床參考價(jià)值較大。

關(guān)鍵詞：非結(jié)核分枝桿菌;PNB/TCH;基因芯片;菌種鑒定

中圖分類號(hào)：R440 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.054

文章編號(hào)：1006-1959（2019）20-0170-02

Comparison of PNB/TCH Growth and DNA Microarray Gene Chips for

Identification of Nontuberculous Mycobacteria

WANG Jian1，HU Li-zhen1，ZHANG Guo-cui1，ZHAO Hui2，CHEN Zi-fang1

Abstract：Objective ?To compare the growth of non-tuberculous mycobacteria （NTM） clinical isolates with p-nitrobenzoic acid/thiophene-2-carboxylate growth （PNB/TCH） and DNA microarray microarray.Methods ?A total of 2175 strains of Mycobacterium phlei isolates in our hospital from January 2013 to June 2018 were collected. PNB/TCH growth test and DNA microarray gene chip were used to identify NTM. Identification of the method.Results ?PNB/TCH growth assay initially identified NTM 93 strain， accounting for 4.28%， DNA microarray gene chip identified NTM 79 strain， accounting for 3.63%， and of the 93 NTMs initially identified by PNB/TCH growth test， 14 were pseudo NTM （ 15.05%）; PNB/TCH growth test identified that the positive detection rate of NTM was lower than that of DNA microarray gene chip; among the 79 strains of NTM， the top 3 were followed by intracellular branching strain （37.97%）， Kansas Mycobacterium （21.52%）， Mycobacterium avium （16.46%）. Conclusion ?The traditional p-nitrobenzoic acid/thiophene-2-carboxylic acid oxime growth test has low specificity of NTM. The DNA microarray gene chip technology is used to identify NTM accurately， and the clinical reference value is large.

Key words：Non-tuberculous mycobacteria;PNB/TCH;Gene chip;Strain identification

近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)。全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，NTM發(fā)病率1984～1985年為4.2%，1990年為4.9%，2000年為11.1%，而2010年增至22.9%[1]。隨著NTM發(fā)病率逐年升高，臨床對(duì)NTM的診斷和鑒別診斷尤為重要，早期確診有助于臨床及時(shí)治療，在一定程度上避免誤診誤治。研究顯示，傳統(tǒng)對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼（PNB/TCH）生長(zhǎng)試驗(yàn)可初步鑒定NTM，但不能鑒定菌種。DNA微陣列基因芯片可鑒定17種分枝桿菌，具有較高的鑒定價(jià)值。本研究收集2013年1月～2018年6月濱州市結(jié)核病防治院住院患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性分枝桿菌2175株，分別采用PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和DNA微陣列基因芯片法鑒定分枝桿菌菌種，旨以評(píng)價(jià)兩種方法在結(jié)核病臨床診斷和鑒別診斷中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源 ?選擇2013年1月～2018年6月濱州市結(jié)核病防治院住院肺結(jié)核患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性分離菌株2175株（例）;培陽(yáng)分離菌株患者中男性1264例，女性911例，年齡19～76歲，平均年齡（48.01±13.07）歲。所有痰培養(yǎng)采用酸性羅氏培養(yǎng)法，酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》操作[2]。

1.2方法

1.2.1 PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn) ?將PNB用二甲基甲酰胺溶解稀釋后加入未凝固的改良羅氏培養(yǎng)基中，最終濃度控制在0.5 mg/ml;TCH用滅菌蒸餾水溶解，培養(yǎng)基中最終濃度為5 μg/ml。PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行[2]。

1.2.2 DNA微陣列基因芯片法 ?DNA微陣列基因芯片檢測(cè)利用TM-Ⅱ芯片雜交儀、TM8芯片洗干儀、10K-B芯片掃描儀等設(shè)備，試劑為晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法），由博奧生物有限公司提供。分別用無(wú)菌取菌環(huán)挑取1個(gè)肉眼可見的菌落，加入含50 μl核酸提取液的核酸提取管中，使用核酸提取儀震蕩5 min，確保菌株完全破碎，將核酸提取管置于95℃水浴5 min，取出核酸提取管，5000 r/min離心1 min，所得核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交和掃描判讀。結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測(cè)和分枝桿菌菌種鑒定實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按基因芯片法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3質(zhì)量控制 ?PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)質(zhì)量控制按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]要求進(jìn)行;DNA微陣列基因芯片法每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行鑒定檢測(cè)時(shí)，芯片內(nèi)部設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控。1個(gè)分枝桿菌屬質(zhì)控，1個(gè)結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控，2個(gè)芯片制備質(zhì)控，2個(gè)芯片雜交質(zhì)控，1個(gè)空白對(duì)照質(zhì)控，1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)控，以及靶基因ropB、KatG和inhA擴(kuò)增質(zhì)控。如果其中任何一個(gè)質(zhì)控結(jié)果錯(cuò)誤，則標(biāo)本結(jié)果定位無(wú)效，需要進(jìn)行復(fù)檢。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)收集數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，陽(yáng)性檢出率采用（n，%）表示。

2結(jié)果

2.1分枝桿菌鑒定結(jié)果 ?2175株分枝桿菌經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和DNA微陣列基因芯片鑒定，分別檢出NTM 93株和79株，MTB菌株分別為2082株和2096株;在PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)初步鑒定的93株NTM中，有14例為假NTM，占15.05%（14/93）;PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率為99.36%（2161/2175），低于DNA微陣列基因芯片法的100.00%（2175/2175）。

2.2 NTM菌種分布情況 ?79株NTM中，胞內(nèi)分枝桿菌30株（37.97%）、堪薩斯分枝桿菌17株（21.52%）、鳥分枝桿菌13株（16.46%）、戈登分枝桿菌9株（11.39%）、草分枝桿菌6株（7.60%）、龜/膿腫分枝桿菌 4株（5.06 %）。

3討論

目前，NTM對(duì)人類健康的威脅越來(lái)越受到臨床重視，NTM感染在患者之間的傳播很少，絕大多數(shù)感染是環(huán)境中細(xì)菌引起的，這與肺結(jié)核通過人與人之間傳播有很大差異。傳統(tǒng)NTM的初步鑒定依據(jù)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)，但該方法存在一定的局限性，受到多種因素的影響：①接種PNB/TCH菌液的濃度;②化療對(duì)分枝桿菌活力損傷的程度;③培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的限制性;④培養(yǎng)基保存時(shí)間對(duì)PNB/TCH藥效的影響。特別是商品化PNB/TCH培養(yǎng)基有效期（1個(gè)月）的延長(zhǎng)，使得PNB/TCH藥效下降，在鑒定中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性菌株。DNA微陣列基因芯片鑒定是以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，其特異性和敏感性均較高，該法不僅可用于菌株的鑒定，還可直接用于涂陽(yáng)標(biāo)本的鑒定，因而可以在疾病早期診斷菌株感染情況。

劉海燦等[3]報(bào)道，450株被初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株中，經(jīng)基因測(cè)序等分子生物學(xué)方法檢測(cè)，有45株被鑒定為結(jié)核分枝桿菌，約占10%。柳正衛(wèi)等[4]報(bào)道，70株初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的菌株，經(jīng)過DNA微陣列芯片法和16 sRNA測(cè)序法再次菌種鑒定檢測(cè)，61.43%（43/70）為結(jié)核分枝桿菌。均驗(yàn)證了DNA微陣列技術(shù)鑒定分枝桿菌的特異性高于PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，2175株分枝桿菌經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和DNA微陣列基因芯片鑒定分別檢出結(jié)核分枝桿菌2082株和2096株，檢出NTM 93株和79株，而在PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)初步鑒定的93株NTM中，有14例為假NTM，占15.05%（14/93）。與上述報(bào)道結(jié)果基本一致。因治療肺結(jié)核病和NTM感染的方案差異較大，因而鑒定NTM菌株對(duì)臨床診治有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，79株NTM中胞內(nèi)分枝桿菌株占比最高，為37.97%，其次為堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌，分別占21.52%和16.46%。有研究顯示，北京市721株分枝桿菌檢出NTM 93株（12.9%），以膿腫分枝桿菌占首位;衢州地區(qū)NTM檢出率為3.93%，以胞內(nèi)分枝桿菌株居多（占52.69%）[5]。與本次研究結(jié)果不同，可見NTM發(fā)病率不同地區(qū)相差懸殊，可能與生存環(huán)境及生活習(xí)性等有關(guān)。

綜上所述，傳統(tǒng)對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定NTM特異性較低，采用DNA微陣列基因芯片技術(shù)鑒定NTM準(zhǔn)確，臨床參考價(jià)值較大。

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收稿日期：2019-6-25;修回日期：2019-7-19

編輯/錢洪飛