王彥玲 劉永 劉英奎 胡書群

摘 ?要：目的：構(gòu)建并鑒定大鼠GABAAR（γ-氨基丁酸A受體）β2亞基真核表達(dá)質(zhì)粒。方法： 以大鼠GABAARβ2亞基基因的cDNA序列為依據(jù)設(shè)計(jì)上游、下游引物，以大鼠總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)T載體定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），酶切后電泳、測序檢測克隆情況。將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，免疫印跡檢測蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：GABAARβ2亞基基因擴(kuò)增成功，并被連接至pcDNA3.1（+），且測序結(jié)果與所查CDS序列一致。免疫印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞采用WB方法檢測到過表達(dá)的GABAARβ2蛋白。結(jié)論：β2-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，并可在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)。

關(guān)鍵詞：GABAA受體;真核表達(dá);質(zhì)粒構(gòu)建

中圖分類號：Q784 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??文章編號：1671-2064（2019）16-0000-00

GABAAR（γ-氨基丁酸A受體）是由5個(gè)亞基組成的異質(zhì)寡聚體跨膜糖蛋白，已鑒定的亞基有：α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、ε、π、θ及ρ1-ρ3^[1]，他們組成不同的亞型發(fā)揮生理作用。α1β2γ2類型是大腦中含量最豐富的亞型^[2]。

研究顯示，β2亞基與多種疾病和生理活動相關(guān)，但是有關(guān)β2亞基在GABAAR功能調(diào)控中的作用機(jī)制仍然有待研究。本研究擬采用RT-PCR技術(shù)獲得大鼠GABARβ2亞基cDNA，并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒，為GABAAR的功能研究提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

總RNA提取試劑盒購自Promega公司，RT-PCR試劑盒購自Takara公司，限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I和T4 DNA連接酶購自NEB公司;PCR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成;羊抗GABAAR β2抗體和驢抗羊IgG-HRP購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.2菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞

DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pcDNA3.1（+）、GABAAR α1-pcDNA3.1（+）、γ2-pCMS-EGFP質(zhì)粒及HEK293細(xì)胞均由江蘇省腦病生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)、總RNA提取及目的基因擴(kuò)增

根據(jù)大鼠GABAARβ2的編碼序列（NM_012957），在其上下游分別設(shè)計(jì)特異性引物。序列如下：

P1： 5-GGATCCGCCACCATGTGGAGAGTCCGG-3，

P2： 5-CGGAATTCTTAGTTCACATAGTAAAGCC-3.

依RNA提取試劑盒操作流程，提取大鼠海馬總RNA，并以之為模板，加入P1、P2引物，RT-PCR擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化。

1.2.2 β2-T vector克隆載體的構(gòu)建

純化的β2基因片段連接pGEM-T vector，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂培養(yǎng)基篩選陽性克隆。選取單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，并委托南京金斯瑞公司進(jìn)行測序。

1.2.3 β2-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體的構(gòu)建

測序正確的重組克隆載體質(zhì)粒和pcDNA3.1（+）行BamH I、EcoR I雙酶切，并分別純化。純化的目的片段亞克隆入pcDNA3.1（+），轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆，行BamH I、EcoR I雙酶切及測序鑒定。將測序正確的重組質(zhì)粒大量制備，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基^[3]，37℃、5% CO₂條件下恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞密度適宜時(shí)，重組質(zhì)粒與 α1-pcDNA3.1（+）、γ2-pCMS-EGFP質(zhì)粒PEI法共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 蛋白含量測定

收集的細(xì)胞超聲破碎后，采用BCA法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定蛋白濃度。

1.2.6免疫印跡檢測GABAARβ2蛋白的表達(dá)

50 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上。3% BSA 孵育4 h后，羊抗GABAAR β2抗體4℃孵育過夜，HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育45 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法 （ECL） 試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABAARβ2-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體構(gòu)建

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：提取的總RNA 18 S、28 S條帶明亮，且28S條帶亮度約為18 S條帶亮度的兩倍，表明提取的RNA完整性良好（圖1A）。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1400 bp附近有一明亮條帶，與 β2亞基（14245bp）分子量大小一致。（圖1B）。β2-T vector雙酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)兩條條帶，分別在約3000bp和1400bp處，與T vector（3000bp）和 β2亞基分子量大小相符（圖1C）;β2-pcDNA3.1（+）雙酶切產(chǎn)物在約5000 bp和1400 bp處分別有一明亮條帶，與pcDNA3.1（+）（5400bp）和 β2亞基分子量大小相符（圖1D）。經(jīng)測序分析，被測基因序列與所查的CDS序列完全一致。結(jié)果表明，GABAAR β2-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M：1Kb DNA marker; 1：GABAARβ2亞基PCR/雙酶切產(chǎn)物。

Cell： 空細(xì)胞組;vector： 轉(zhuǎn)染空載體組;αβγ： α1β2γ2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組

2.2 蛋白表達(dá)鑒定

免疫印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組可檢測到顯著的β2蛋白條帶（圖2）。表明構(gòu)建的 β2-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)質(zhì)?？稍贖EK293細(xì)胞中高效表達(dá)。

3 討論

近幾年，對于β2亞基功能的研究日益增多。有研究表明，在酒精依賴中，β2亞基發(fā)揮了重要作用^[4]。β2亞基還參與了低頻電刺激對癲癇的治療^[5]。本研究成功構(gòu)建了GABAAR β2亞基的真核表達(dá)質(zhì)粒，并可在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。通過與其它亞基質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，可在分子水平研究GABAAR及其β2亞基的功能。

參考文獻(xiàn)

• Simon，J; Wakimoto，H;Fujita，N; et al. Analysis of the set of GABA（A） receptor genes in the human genome[J].J Biol Chem，2004，279（40）：41422-41435.
• Deniz， S; Wersinger， E; Picaud， S; et al. Evidence for functional GABAA but not GABAC receptors in mouse cone photoreceptors[J].Vis Neurosci，2019，36：E005.
• 岳軍，齊素華.p38α半胱氨酸點(diǎn)突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2015，18（01）：19-21.
• 孫利凈，韓秋月，胡滿.γ-氨基丁酸（GABA）受體的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（07）：80-83.
• 楊光明，王峰，李楊，等.海馬低頻電刺激對KA點(diǎn)燃大鼠GABAA受體α1和β2亞基表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，5：382-385. ?

收稿日期：2019-06-21

*基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（BK20181471）;江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX11_0727）。

作者簡介：王彥玲（1987—），女，山東濟(jì)寧人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：缺血性腦病的分子機(jī)制和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

通訊作者：劉永（1974—），男，江蘇灌云人，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。