田忠昌 褚志杰 楊天保 劉偉峰 楊延輝 孫君軍

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病死率位居所有腫瘤的第2位[1]。國(guó)內(nèi)最新癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，肝癌在男性中的發(fā)生率居第3位、病死率居第2位[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌最常見的病理類型，占肝癌發(fā)病人群的80%以上。早期診治仍然是提高HCC患者生存預(yù)后的重要途徑。然而，因臨床中缺乏肝癌早期診斷的標(biāo)志物，大部分HCC患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后極差[3]。因此，臨床中亟待開發(fā)新型的腫瘤標(biāo)志物用于HCC的早期診斷。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類來源于內(nèi)含子和(或)外顯子，通過反向剪接產(chǎn)生、序列保守、具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的特殊RNA[4,5]。近年來越來越多的研究證實(shí)，circRNA在HCC的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，提示這些circRNA分子有望成為HCC早期診斷的新型腫瘤標(biāo)志物[6～14]。本研究擬通過定量的Meta分析，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)circRNA對(duì)HCC的綜合診斷效能。

資料與方法

1.資料檢索策略：檢索PubMed、EMBASE、知網(wǎng)(CNKI)、萬方、維普等在線期刊數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間為建庫至2018年12月的中英文文獻(xiàn)。檢索主題詞為 “肝癌”、“肝細(xì)胞癌”、 “環(huán)狀RNA”、“環(huán)形RNA”、“診斷”、“circRNA”、“circular RNA”、“hepatocellular carcinoma”、“hepatocellular cancer”、“l(fā)iver caner”、“diagnosis”等，以單個(gè)或組合形式進(jìn)行檢索。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：①關(guān)于circRNA和HCC的相關(guān)研究，研究對(duì)象為Ⅰ～Ⅳ期的肝細(xì)胞癌初診患者，需經(jīng)病理確診；②研究對(duì)病例、對(duì)照組的類型界定明確，包括具體例數(shù)，且病例數(shù)不低于20例；③研究的數(shù)據(jù)可用于直接或間接構(gòu)建2×2診斷四格表。排除標(biāo)準(zhǔn)：①提供的數(shù)據(jù)不能構(gòu)建2×2診斷四格表，且聯(lián)系作者獲取原始數(shù)據(jù)失??；②評(píng)價(jià)后的低質(zhì)量文獻(xiàn)；③非臨床診斷研究，如基礎(chǔ)研究、綜述、病例報(bào)告、信件、評(píng)論、會(huì)議摘要、重復(fù)發(fā)表的論文等。

3.數(shù)據(jù)提?。簝晌蛔髡擢?dú)立提取文獻(xiàn)數(shù)據(jù)資料，包括論文標(biāo)題、第一作者姓名、發(fā)表年份、研究人群、對(duì)照組和病例組樣本例數(shù)、樣本類型、circRNA 類型、Cut-off值、內(nèi)參基因類型、檢測(cè)方法。提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行相互核對(duì)，不一致之處經(jīng)討論解決。

4.文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)：采用QUADAS-2量表工具評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)質(zhì)量[15]。分別從“病例選擇”、“待評(píng)價(jià)試驗(yàn)”、“金標(biāo)準(zhǔn)”和“病例流程和進(jìn)展”等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)每部分納入的相關(guān)性問題，對(duì)應(yīng)偏倚風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)判定為 “低(評(píng)分1分)”，“高(評(píng)分0分)”或“不確定(評(píng)分0分)”。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：通過Meta-Disc 1.4、Stata 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。合并的診斷相關(guān)統(tǒng)計(jì)量包括敏感度、特異性、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)，診斷比值比(DOR)、曲線下面積(AUC)曲線及對(duì)應(yīng)的95%CI。采用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，同時(shí)經(jīng)Cochran′Q和I2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)非閾值效應(yīng)來源的異質(zhì)性大小，P<0.05或I2>50%提示研究間有顯著異質(zhì)性。研究間存在顯著異質(zhì)性時(shí)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并統(tǒng)計(jì)量，否則采用固定效應(yīng)模型。通過亞組分析和敏感度分析引起異質(zhì)性的原因。通過Deek′s定量漏斗圖評(píng)估發(fā)表間偏倚，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.文獻(xiàn)納入：文獻(xiàn)的納入與排除流程如圖1所示，根據(jù)檢索策略剔除重復(fù)文獻(xiàn)后，共檢索得到相關(guān)文獻(xiàn)237篇。通過閱讀標(biāo)題和摘要排除205篇，剩余32篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文評(píng)估，進(jìn)一步剔除不符合文獻(xiàn)22篇(包括綜述5篇，預(yù)后相關(guān)文獻(xiàn)10篇及其他非診斷相關(guān)文獻(xiàn)7篇)，最終納入關(guān)于circRNA與HCC的診斷性文獻(xiàn)共10篇。

圖1 文獻(xiàn)的納入與排除流程圖

2. 納入文獻(xiàn)資料特點(diǎn)和質(zhì)量評(píng)估：納入文獻(xiàn)的特征如表1所示。本研究共納入HCC病例858例，非癌對(duì)照組885例，包含慢性肝炎/肝硬化164例，健康對(duì)照88例，匹配癌旁對(duì)照412例。所有HCC患者均經(jīng)過組織病理學(xué)檢查確診。所有circRNA分子均經(jīng)qRT-PCR方法檢測(cè)，以GAPDH或β-actin 為參照基因。HCC中表達(dá)上調(diào)的circRNA包括hsa_circ_0091582、hsa_circ_0128298、hsa_circ_000224、hsa_circ_0005075、hsa_circ_16245-1和hsa_circ_0091579等，表達(dá)下調(diào)的包括hsa_circ_0003570、hsa_circ_0004018、hsa_circ_001565、hsa_circ_000520、Hsa_circ_0001649、circZKSCAN1和hsa_circ_0001445等。采用QUADAS-2條目對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，納入的10篇文獻(xiàn)評(píng)分均≥4分，提示納入研究的質(zhì)量相對(duì)較高。納入研究的偏移比例分布情況詳見圖2。

3.異質(zhì)性分析：分別通過Spearman相關(guān)系數(shù)、Cochran-Q值和I2檢驗(yàn)評(píng)估研究間異質(zhì)性。整體合并效應(yīng)量結(jié)果顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)=-0.084，P=0.741, 表明研究間不存在閾值效應(yīng)來源的異質(zhì)性；Cochran′Q=81.24，P=0.000，I2=79.1%。

表1 納入診斷文獻(xiàn)的資料特征

圖2 QUADAS-2評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)的偏移分布

4.診斷性能：如圖3所示，circRNA用于診斷HCC的合并敏感度、特異性、PLR、NLR和DOR分別為78%(95%CI：76%～80%)、78%(95%CI：75%～80%)、3.60 (95%CI：2.73～4.75)、0.24(95%CI：0.17～0.34)和17.29(95%CI：10.28～29.07)，受試者工作特征曲線(SROC)曲線下面積(AUC)為0.877。

圖3 合并的受試者工作特征曲線(SROC)

5.亞組分析：本研究將不同標(biāo)本類型、對(duì)照類型、circRNA表達(dá)狀態(tài)、內(nèi)參基因類型和研究人群分別做亞組分析。表2結(jié)果顯示，以血清為檢測(cè)基質(zhì)的circRNA檢測(cè)診斷HCC的效能優(yōu)于血漿和組織(敏感度：89% vs 79% vs 74%；特異性：88% vs 65% vs 79%；AUC：0.929 vs 0.724 vs 0.859)；circRNA在區(qū)分HCC和健康對(duì)照時(shí)效能最高(AUC=0.929)，其次為區(qū)分HCC和癌旁對(duì)照(AUC=0.824)，circRNA用于區(qū)分HCC和肝炎/肝硬化時(shí)效能最低(AUC=0.730)?；赾ircRNA表達(dá)狀態(tài)結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的circRNA表達(dá)譜診斷HCC的能力高于下調(diào)的表達(dá)譜(AUC：0.863 vs 0.836)；在人群分析中，circRNA診斷HCC在非洲人群中的合并AUC為0.929，敏感度為89%，特異性為88%，明顯高于亞洲人群。此外，基于GAPDH為內(nèi)參照的circRNA診斷HCC的效能高于β-actin(AUC：0.859 vs 0.762)。

表2 cirRNA用于HCC診斷時(shí)基于不同變量的亞組分析結(jié)果

6.敏感度分析：未檢測(cè)到研究間存在超過上限或下限的離群數(shù)據(jù)，提示研究間的同質(zhì)性較高，合并結(jié)果較可靠(圖4)。

圖4 敏感度分析顯示研究間的同質(zhì)性

7.發(fā)表偏倚：本研究經(jīng)Deek′s定量漏斗圖評(píng)估納入文獻(xiàn)的潛在發(fā)表偏倚，P=0.286，說明研究間不存在發(fā)表偏倚(圖5)。

圖5 Deek′s定量漏斗圖檢測(cè)研究發(fā)表偏倚

討 論

肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)已成為引起死亡的最常見惡性消化系統(tǒng)腫瘤之一[1]。我國(guó)是HCC的高發(fā)國(guó)家，且其發(fā)生率呈一定的上升趨勢(shì)[2]。HCC具有發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差的特點(diǎn)，因此早期診斷治療是提高患者預(yù)后的重要手段之一[3]。近年來，一些研究證實(shí)環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在HCC的診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但因研究間的樣本量、人群等差異，其診斷價(jià)值尚存爭(zhēng)議。本研究系統(tǒng)性評(píng)估了circRNA對(duì)HCC的綜合診斷效能，為circRNA更好地用于HCC臨床診斷提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

本研究對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的circRNA分子進(jìn)行Meta分析。共納入診斷性研究共10篇，包含HCC病例858例，非癌對(duì)照組885例。通過系統(tǒng)性分析，對(duì)HCC中表達(dá)上調(diào)的circRNA包括hsa_circ_0091582、hsa_circ_0128298、hsa_circ_000224、hsa_circ_0005075、hsa_circ_16245-1和hsa_circ_0091579等，以及表達(dá)下調(diào)的circRNA分析包括hsa_circ_0003570、hsa_circ_0004018、hsa_circ_001565、hsa_circ_000520、Hsa_circ_0001649、circZKSCAN1和hsa_circ_0001445等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量合并，得到總體circRNA表達(dá)譜的效應(yīng)模型。結(jié)果顯示，circRNA用于診斷HCC的合并敏感度和特異性均為78%，受試者工作特征曲線(SROC)曲線下面積(AUC)為0.877，提示整體的診斷效能較高。此外，陽性似然比PLR為3.60提示HCC患者中circRNA表達(dá)異常改變的概率是對(duì)照組的3.6倍；陰性似然比為0.24，提示假陰性的概率較低。診斷的比值比(DOR)是評(píng)價(jià)一項(xiàng)診斷實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)效能的重要指標(biāo)之一，其值越大，提示診斷的診斷效能越高，當(dāng)DOR的值<1時(shí)，提示一項(xiàng)檢測(cè)的診斷效能很低[16]。本研究中獲得的DOR為17.29，提示整體的診斷效能很高。以上數(shù)據(jù)充分顯示，異常表達(dá)的circRNA可很好應(yīng)用于HCC診斷。

本研究進(jìn)一步將不同標(biāo)本類型、對(duì)照類型、circRNA表達(dá)狀態(tài)、內(nèi)參基因類型和研究人群分別做亞組分析，也得到很多有意義的結(jié)果。以血清為檢測(cè)基質(zhì)的circRNA檢測(cè)AUC可達(dá)0.929，效能明顯優(yōu)于血漿和組織，提示血清可作為circRNA表達(dá)檢測(cè)的很好的樣本類型。目前已有證據(jù)證實(shí)不同樣本類型來源的游離核酸對(duì)腫瘤診斷的差異[17,18]。本研究另外發(fā)現(xiàn)circRNA在區(qū)分HCC和健康對(duì)照時(shí)效能最高(AUC=0.929)，其次為區(qū)分HCC和癌旁對(duì)照(AUC=0.824)，circRNA用于區(qū)分HCC和肝炎/肝硬化時(shí)效能最低(AUC=0.730)。此外，筆者發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的circRNA表達(dá)譜診斷HCC的能力稍高于下調(diào)的表達(dá)譜(AUC：0.863 vs 0.836)。在人群分析中，circRNA診斷HCC在非洲人群中的診斷效能明顯高于亞洲人群。此外，基于不同內(nèi)參基因的亞組分析GAPDH較β-actin可能更利于診斷性的circRNA檢測(cè)分析。

本項(xiàng)Meta分析仍存在一定局限性：(1)納入分析的10項(xiàng)研究大部分來自中國(guó)，得到的結(jié)論可能存在一定的地域人群差異性，且納入的非洲人群僅為埃及人群，缺乏一定代表性。(2)研究間存在一定的異質(zhì)性，因此本結(jié)果不能完全準(zhǔn)確反映circRNA在HCC中的綜合診斷價(jià)值。(3)亞組分析盡管得到一些新的結(jié)論，但因分組后樣本量減小，再次合并后可能導(dǎo)致有些偏移增大。因此，還有待于開展大樣本、高質(zhì)量的研究進(jìn)一步證實(shí)。