程 玉 李 明 譚詩(shī)云 周中銀

在全球惡性腫瘤中，大腸癌的發(fā)生率位居第4位，病死率位居第2位，每年有超過(guò)120萬(wàn)新增病例，并有超過(guò)60萬(wàn)病例死亡[1, 2]。外科手術(shù)是目前最有效的治療方法，而對(duì)于大腸癌晚期患者，放、化療則是主要的治療手段。盡管抗腫瘤治療不斷取得進(jìn)展，但進(jìn)展期大腸癌的總體療效仍不盡如人意。常規(guī)傳統(tǒng)的化療藥物毒性不良反應(yīng)較大，對(duì)患者生活質(zhì)量影響也較大，患者耐受差，因此，需要積極探索新的治療手段。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境的生存機(jī)制[3～5]。經(jīng)研究證實(shí)，自噬與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[6]。

丹皮酚(paeonol)是一種從牡丹中分離出來(lái)的天然酚類(lèi)化合物，具有多種功效。其藥理學(xué)活性廣泛，鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、肝腎保護(hù)、降低血糖、免疫調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)、抗菌、解熱鎮(zhèn)痛、抗過(guò)敏、抑制血小板聚集和中樞抑制等作用[7～11]。本研究擬觀察丹皮酚對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.藥品試劑:丹皮酚[寧波天真藥業(yè)有限公司(純度>98%)]；AnnexinV/PI試劑盒(德國(guó)Bender公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)液及蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學(xué)研究所)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔及6孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；Bcl-2、Bax、自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白及內(nèi)參β-actin抗體抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物科技有限公司)。

2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：大腸癌LoVo細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。主要儀器：Cytoflex流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)、Enspire多功能酶標(biāo)分析儀(美國(guó)PerkinElmer公司)、MCO-170MUVL培養(yǎng)箱(日本Panasonic公司)、GloMax 20/20型發(fā)光檢測(cè)儀(美國(guó)Promega公司)、LYNX 6000冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、空白組、對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和空白組分別加入濃度為0、30、60、120、240mg/L的丹皮酚，對(duì)照組不加丹皮酚。

3.細(xì)胞處理：大腸癌LoVo細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件的恒溫箱中孵育，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化離心洗滌后重懸。根據(jù)不同檢測(cè)方法調(diào)整細(xì)胞接種濃度及培養(yǎng)時(shí)間。

4.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：將上述處理后的大腸癌LoVo細(xì)胞按5×104/ml接種于96孔板，每孔200μl，培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁。將上述貼壁細(xì)胞分別加入實(shí)驗(yàn)組和空白組中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，每孔加入20μl的CCK-8試劑，待培養(yǎng)液顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的吸光度值(A值)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%，以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞增殖情況。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：按1×105/ml濃度將大腸癌LoVo接種至6孔板內(nèi)，每孔2ml，直至細(xì)胞貼壁。將貼壁后的細(xì)胞加入不同實(shí)驗(yàn)分組中，處理48h后收集細(xì)胞，均加入500μl緩沖液進(jìn)行重懸。各實(shí)驗(yàn)分組中分別加入PI及Annexin Ⅴ試劑5μl，避光室溫孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

6.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡及自噬相關(guān)蛋白:用200μl預(yù)冷的含PMSF的蛋白裂解液裂解上述細(xì)胞，用移液器反復(fù)抽吸后震蕩、離心，將上清液移至經(jīng)高壓消毒的EP管內(nèi)。各組中取40μg等量蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用5%BSA封閉，依據(jù)蛋白分子量進(jìn)行相應(yīng)切割，加入一抗，于室溫下孵育，2h后再次洗膜、顯色、顯影。根據(jù)蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并計(jì)算蛋白質(zhì)含量，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

結(jié) 果

1.丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用:經(jīng)不同濃度丹皮酚處理LoVo細(xì)胞，分別于24、48、72h后結(jié)束培養(yǎng)，CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。在相同藥物濃度下，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞存活率越低；在相同作用時(shí)間內(nèi)，丹皮酚藥物濃度越高，細(xì)胞存活率越低；同對(duì)照組(0mg/L)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞存活率的作用與0mg/L比較，*P<0.05

2.丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用：采用PI/Annexin Ⅴ雙染標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(圖2)。丹皮酚處理48h后可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，30、60、120mg/L丹皮酚組的細(xì)胞凋亡率分別為13.43%±2.34%、22.26%±2.28%和36.25%±3.21%，與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率3.24%±1.35%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖2 丹皮酚誘導(dǎo)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖A.0mg/L;B.30mg/L;C.60mg/L;D.120mg/L

圖3 丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡率的作用與0mg/L比較，*P<0.05

3.丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的作用:丹皮酚(0、30、60、120mg/L)處理LoVo細(xì)胞48h后，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量逐漸降低，同時(shí)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量逐漸增加(圖4)。

圖4 丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的作用

4.丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的作用:大腸癌LoVo細(xì)胞經(jīng)不同濃度丹皮酚(0、30、60、120mg/L)處理48h后，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)量逐漸增加(圖5)。

圖5 丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的作用

討 論

盡管近年來(lái)在腫瘤治療等方面取得了許多重大進(jìn)步，新的抗腫瘤藥或方案層出不窮，但進(jìn)展期大腸癌患者的生存率并未明顯提高，進(jìn)展期大腸癌患者的生存率不足2年[12]。因此，新的抗腫瘤方法和策略成為腫瘤治療研究的重點(diǎn)。

丹皮酚是從中草藥牡丹皮中提取的天然酚類(lèi)化合物，丹皮酚能抑制食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、腸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖；目前對(duì)丹皮酚的藥理作用已有了一定的了解，但丹皮酚對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)不僅觀察了不同濃度丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞增殖、凋亡的影響，還通過(guò)自噬相關(guān)基因蛋白檢測(cè)探討其實(shí)現(xiàn)途徑可能是通過(guò)自噬實(shí)現(xiàn)的。

為了觀察丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞增殖和凋亡的影響，首先按照不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低；同時(shí)，比較了相同濃度處理不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也逐漸降低，即丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴(lài)效應(yīng)。然后，采用PI/Annexin Ⅴ雙染檢測(cè)丹皮酚對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈量-效關(guān)系。上述兩者結(jié)果提示丹皮酚可抑制大腸癌LoVo細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡具有重要作用的Bcl-2和Bax蛋白進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚處理大腸癌LoVo細(xì)胞后，隨著藥物濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量逐漸降低，且促凋亡蛋白Bax逐漸升高。細(xì)胞凋亡過(guò)程受凋亡相關(guān)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控，Bcl-2與Bax均屬于Bcl-2家族，Bcl-2是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵抑制劑，其在多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，包括大腸癌，Bcl-2在高分化癌癥中的表達(dá)更高[13]。Bax能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且Bax可直接激活死亡效應(yīng)因子caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，且Bax與Bcl-2同源，Bax的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl-2的抗凋亡效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此，Bax的存在可能與更好的預(yù)后相關(guān)[14]。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，自噬的溶酶體降解途徑在細(xì)胞、組織和機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，控制自噬的基因突變與癌癥發(fā)生有明確的因果聯(lián)系。自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中扮演著復(fù)雜又重要的角色，是一種細(xì)胞生存機(jī)制[15]。在形成腫瘤前自噬發(fā)揮抑癌作用，但當(dāng)腫瘤形成后，因缺氧等不利因素，自噬維持腫瘤的生存功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚處理后，大腸癌LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示丹皮酚可誘導(dǎo)大腸癌LoVo細(xì)胞自噬水平升高。

綜上所述，經(jīng)丹皮酚處理后，大腸癌LoVo細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率增加，且抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白量表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加，同時(shí)，丹皮酚也可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生自噬。由此提示丹皮酚可能通過(guò)促進(jìn)大腸癌LoVo細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，丹皮酚對(duì)大腸癌具有抗腫瘤作用，為大腸癌的治療提供了新的治療策略和方法。丹皮酚對(duì)大腸癌腫瘤侵襲的相關(guān)性報(bào)道仍較少，筆者也將進(jìn)一步探討丹皮酚誘導(dǎo)的自噬在細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲中的作用機(jī)制[17]。