韓翠翠 劉立琨 王玉春 楊 瑩 馬立威

研究認(rèn)為乳腺癌發(fā)病機(jī)制可能與惡性表征相關(guān)基因的異常有關(guān)。TOX3為高遷移率(high mobility group，HMG)蛋白家族成員3基因，又名三核苷酸重復(fù)9基因(trinucleotide repeat-containing gene 9，TNRC9)，CAG三核苷酸重復(fù)基因F9 基因(CAG trinucleotide repeat-containing gene F9，CAGF9)[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道，TOX3可能參與腫瘤的發(fā)展。在不同人群的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)中發(fā)現(xiàn)TOX3與乳腺癌易感性相關(guān)，其在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與臨床TNM分期分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，但其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的生物學(xué)功能以及調(diào)控機(jī)制尚不清楚[2～7]。因此，本研究在前期構(gòu)建穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)TOX3基因細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，初步探討靶向調(diào)控TOX3基因的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活性以及周期的影響，為進(jìn)一步探討TOX3基因在乳腺癌惡性病變過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：人乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，穩(wěn)定沉默TOX3基因的的乳腺癌細(xì)胞(TOX3-shRNA細(xì)胞)、陰性對(duì)照細(xì)胞(LV3-NC細(xì)胞)、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TOX3基因乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231-TOX3細(xì)胞)和陰性對(duì)照細(xì)胞(MDA-MB-231-NC細(xì)胞)模型均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；L-15培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco Technology 公司；BCA 蛋白定量試劑盒和ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TOX3兔抗人單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GAPDH鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；抗兔二抗和抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2. 方法：將已構(gòu)建的穩(wěn)定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞系分為空白對(duì)照組(ZR-75-1細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(LV3-NC細(xì)胞)和TOX3干擾組(TOX3-shRNA細(xì)胞)；穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞分為空白對(duì)照組(MDA-MB-231細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(MDA-MB-231-NC細(xì)胞)和TOX3過(guò)表達(dá)組(MDA-MB-231-TOX3細(xì)胞)。(1)Western blot法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞TOX3蛋白的表達(dá)：將各組細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，收集各組細(xì)胞，各組細(xì)胞按照一定比例加入含有PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA強(qiáng)效裂解液，冰上提取總蛋白，離心，收集蛋白液。BCA法檢測(cè)提取蛋白液濃度并進(jìn)行定量，經(jīng)變性后，取20μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉液4℃封閉，過(guò)夜。按照1∶2000比例加入TOX3單克隆抗體，1∶3000比例加入GAPDH抗體，室溫孵育3h后，洗膜3次。1∶3000比例加入抗兔二抗和抗鼠二抗，室溫孵育2h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，曝光。(2)MTT法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾TOX3對(duì)MDA-MB-231和ZR-75-1細(xì)胞增殖活性的影響：將各組細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為3000個(gè)/孔，接種于96孔板內(nèi)，每組平行設(shè)5個(gè)復(fù)孔，過(guò)夜。次日棄掉舊培養(yǎng)基，每孔加入200μl新鮮L-15或1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。于檢測(cè)當(dāng)日加入20μl 5mg/ml的MTT溶液(注意避光)，37℃孵育4h，終止培養(yǎng)，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO溶液，室溫充分震蕩使結(jié)晶溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值，觀察第0～7天的細(xì)胞增殖活性的變化。(3)平板單克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TOX3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞單克隆形成能力的影響：將過(guò)表達(dá)TOX3的MDA-MB-231各組細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，以3000個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔板內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，視生長(zhǎng)狀況換液，連續(xù)培養(yǎng)14天后，吸去舊培養(yǎng)基，PBS清洗兩次。采用冰甲醇固定10min，PBS清洗，結(jié)晶紫溶液染色10min，洗去結(jié)晶紫。計(jì)細(xì)胞數(shù)>50個(gè)的集落數(shù)，計(jì)算集落形成率。集落形成率(%)=計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)TOX3基因后乳腺癌細(xì)胞周期變化：將各組細(xì)胞常規(guī)消化，以1×106個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。常規(guī)消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液到離心管中，2000r/min離心5min，棄掉上清。加入預(yù)冷的PBS懸浮細(xì)胞，2000r/min離心5min。棄掉上清液，再次加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，離心。棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹散細(xì)胞，4℃固定，過(guò)夜。離心，棄掉乙醇，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。離心，棄掉PBS，每個(gè)樣品加入0.5ml配制好的碘化丙啶染色液，重懸細(xì)胞，37℃避光反應(yīng)30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。

結(jié) 果

1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞TOX3蛋白的表達(dá)：Western blot法檢測(cè)已構(gòu)建的穩(wěn)定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞系和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TOX3的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系內(nèi)TOX3蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ZR-75-1細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組比較，TOX3干擾組(TOX3-shRNA細(xì)胞)TOX3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，圖1)。轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組比較，TOX3過(guò)表達(dá)組(MDA-MB-231-TOX3細(xì)胞)TOX3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖2)。

圖1 穩(wěn)定沉默TOX3的ZR-75-1細(xì)胞TOX3蛋白的表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TOX3的MDA-MB-231細(xì)胞TOX3蛋白的表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.過(guò)表達(dá)和干擾TOX3基因?qū)DA-MB-231和ZR-75-1細(xì)胞增殖的影響：采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0～7天內(nèi)空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TOX3過(guò)表達(dá)組隨著時(shí)間的推移細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)(圖3)。干擾TOX3后，ZR-75-1細(xì)胞增殖活性降低(圖4)。

圖3 過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖的影響與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4 干擾TOX3基因?qū)R-75-1細(xì)胞增殖的影響與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

3.過(guò)表達(dá)TOX3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞單克隆形成能力的影響：采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TOX3對(duì)細(xì)胞單克隆形成能力的影響。與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組細(xì)胞集落形成率無(wú)明顯變化；與陰性對(duì)照組比較，TOX3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的集落形成率明顯增大，單克隆形成能力增強(qiáng)(P<0.05,圖5)。

圖5 過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞單克隆形成的影響A.各組細(xì)胞平板克隆形成圖；B.各組細(xì)胞平板克隆分析圖；1.空白對(duì)照組；2.陰性對(duì)照組；3.TOX3過(guò)表達(dá)組；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

4.干擾TOX3基因?qū)R-75-1細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾TOX3基因?qū)R-75-1細(xì)胞周期的影響。與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組各周期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。與陰性對(duì)照組比較，TOX3干擾組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，而S期有減少的趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1，圖6)。

表1 干擾TOX3基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞周期的影響

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

5.過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)TOX3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組各周期細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)TOX3組G0/G1期細(xì)胞所占比例減少，G2/M期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)，而S期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，圖7)。

圖6 干擾TOX3基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞周期的影響A.空白對(duì)照組；B.陰性對(duì)照組；C.TOX3干擾組

表2 過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞周期的影響

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

討 論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)TOX3與腫瘤的發(fā)展相關(guān)。組織學(xué)分層分析表明TOX3多態(tài)性位點(diǎn)rs3803662的基因分型CT/TT與彌漫型胃癌較好的生存期相關(guān)[8]。TOX3基因的變異體可能在慢性粒細(xì)胞白血病早期診斷和治療中起重要作用[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染的肺癌組織中，TOX3 mRNA的表達(dá)高于相應(yīng)的癌旁組織，表明TOX3可能與HIV感染的肺癌相關(guān)[10]。然而越來(lái)越多的研究表明TOX3基因與乳腺癌密切相關(guān)。

圖7 過(guò)表達(dá)TOX3基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞周期的影響A.空白對(duì)照組；B.陰性對(duì)照組；C.TOX3過(guò)表達(dá)組

近年來(lái)，在不同人群中的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，TOX3與乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)[2～6]。研究顯示，含有多個(gè)TOX3危險(xiǎn)等位基因的患者大大增加了患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，且TOX3基因多態(tài)性明顯增加了家族乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[11，12]。GWAS研究發(fā)現(xiàn)，TOX3基因上的多態(tài)性位點(diǎn)與雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可作為絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子之一[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)TOX3在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺細(xì)胞中表達(dá)，且在乳腺癌腫瘤中高表達(dá)，TOX3的高表達(dá)與Luminal B型乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)。降低TOX3的表達(dá)，Luminal B型乳腺癌細(xì)胞增殖的能力下降，但TOX3在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能尚不清楚[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織比較，TOX3蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與臨床TNM分期和分級(jí)呈顯著相關(guān)[7]。Shan等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織比較，TOX3在乳腺癌尤其是晚期乳腺癌組織內(nèi)高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)BRCA1的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。沉默TOX3的表達(dá)，可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和ZR-75-1細(xì)胞增殖，其體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)干擾TOX3基因后，成瘤率明顯降低，且形成的腫瘤也明顯減小。以上研究證實(shí)，TOX3基因參與了乳腺癌發(fā)展進(jìn)程，并發(fā)揮重要作用。

筆者前期研究應(yīng)用慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TOX3的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞模型和穩(wěn)定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞模型[16]。本研究在此基礎(chǔ)上檢測(cè)已構(gòu)建的穩(wěn)定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞系和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TOX3的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系內(nèi)TOX3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ZR-75-1細(xì)胞后，TOX3干擾組TOX3蛋白表達(dá)水平明顯降低。轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，TOX3過(guò)表達(dá)組TOX3蛋白表達(dá)水平明顯升高。在此基礎(chǔ)上采用MTT法及平板單克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TOX3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TOX3基因可使MDA-MB-231細(xì)胞增殖和單克隆形成能力增強(qiáng)，干擾TOX3基因可使ZR-75-1細(xì)胞的增殖能力下降，這與Shan等[15]研究發(fā)現(xiàn)的干擾TOX3基因乳腺癌細(xì)胞的增殖能力下降結(jié)果相符。

腫瘤是一種由多原因?qū)е录?xì)胞周期紊亂性疾病。研究認(rèn)為細(xì)胞周期中 G2/M期和S期所占的百分比可反映細(xì)胞的增殖活性[17]。本研究應(yīng)用穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)TOX3基因的乳腺癌細(xì)胞模型，采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)干擾和過(guò)表達(dá)TOX3對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾ZR-75-1細(xì)胞TOX3基因的表達(dá)后，G0/G1期細(xì)胞的比例顯著上升，G2/M期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞比例有減少趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明TOX3基因沉默后，生長(zhǎng)停滯在G0/G1期不能進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞比例增多，細(xì)胞的增殖活性減弱。過(guò)表達(dá)TOX3基因后，MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比減小，G2/M期細(xì)胞所占百分比增大，而S期細(xì)胞比例沒(méi)有明顯變化，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。以上結(jié)果提示TOX3基因可通過(guò)調(diào)控乳腺癌的細(xì)胞周期而影響細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控TOX3基因的表達(dá)可改變?nèi)橄侔┘?xì)胞增殖和單克隆形成能力，影響乳腺癌細(xì)胞周期。