辛 穎 閆 爽

肥胖作為一種由遺傳、環(huán)境、腸道菌群等多種因素作用的慢性代謝性疾病，目前已呈全球流行趨勢(shì)。最新研究資料顯示,截至2015年，全球約有22億超重/肥胖患者，中國(guó)達(dá)5700萬(wàn)，僅次于美國(guó)，位居世界第2位[1]。大量研究證實(shí)，肥胖與糖尿病、心血管疾病、腫瘤等慢性疾病的發(fā)生和死亡密切相關(guān)。因此，治療肥胖癥及其相關(guān)的健康問(wèn)題對(duì)衛(wèi)生保健系統(tǒng)具有重大的影響[2～4]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)有棕色脂肪組織 (brown adipose tissue, BAT)、白色脂肪組織 (white adipose tissue, WAT)和米色脂肪組織(beige adipose tissue，BAT) 3種。肥胖主要表現(xiàn)為白色脂肪數(shù)量的增多和體積的增大，并聚集于腹腔和皮下，以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式儲(chǔ)存過(guò)剩的能量[5]。甘油三酯在脂肪組織與非脂肪組織等部位的過(guò)度蓄積，可導(dǎo)致脂肪組織缺氧、慢性炎性反應(yīng)以及脂肪因子分泌破壞，繼發(fā)全身胰島素抵抗與脂質(zhì)代謝紊亂,因此而誘發(fā)糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NFALD)等[6,7]。

利拉魯肽作為一種人工合成的胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide -1,GLP-1)的類(lèi)似物，因其獨(dú)有的促胰島素分泌(葡萄糖濃度依賴(lài)性)、改善胰島β細(xì)胞功能等特性，目前廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療[8]。近年來(lái)，利拉魯肽作為一種減重藥物為人們所熟知。因GLP-1受體廣泛分布在人體的各個(gè)部位，包括胰腺、胃、十二指腸、肺、心臟、肝臟、腎臟、腦及內(nèi)皮細(xì)胞等[9]。而利拉魯肽可通過(guò)與分布于腦干、下丘腦和杏仁體的GLP-1受體結(jié)合，發(fā)揮中樞性抑制食欲作用，同時(shí)抑制胃腸蠕動(dòng)及分泌功能，延緩胃內(nèi)容物排空，從而達(dá)到減重的效果[10]。2014年美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration of the United States,FDA)批準(zhǔn)利拉魯肽用于慢性體重管理，利拉魯肽3.0mg/d成為肥胖人群尤其伴有高血壓、糖尿病、血脂代謝異常人群減重的輔助治療手段[11]。最近的大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了GLP-1可通過(guò)減輕體重，改善胰島素抵抗和糖代謝，進(jìn)而改善肝臟脂質(zhì)沉積[12]。間斷性禁食(intermittent fasting，IF)是一種新型的通過(guò)飲食干預(yù)減重的方法，主要包括5∶2飲食及隔日禁食，本研究采用隔日禁食(alternate day fasting，ADF)的方式，即正常飲食1日，然后禁食1日，如此循環(huán)[13]。

本研究采用氫質(zhì)子磁共振波譜成像(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)技術(shù)，經(jīng)病理對(duì)照研究證實(shí)，1H-MRS不僅是活體下測(cè)量體內(nèi)TG含量最準(zhǔn)確、最可靠的影像學(xué)手段，還是對(duì)非酒精性脂肪肝定性和定量有效的方法[14,15]。本研究主要對(duì)C57BL6小鼠進(jìn)行高脂肥胖小鼠造模，探討利拉魯肽的減重效果，及對(duì)小鼠體內(nèi)不同部位、不同性質(zhì)脂肪內(nèi)甘油三酯含量的變化情況，以及與嚴(yán)格飲食控制即隔日禁食法干預(yù)比較，利拉魯肽對(duì)脂肪組織代謝的影響是否完全依賴(lài)于體質(zhì)量減輕。

材料與方法

1.材料：SPF級(jí)C57BL6雄性小鼠 32只, 6周齡，體質(zhì)量約23±10g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。利拉魯肽(諾和力) 購(gòu)自丹麥諾和諾德公司;小動(dòng)物9.4T MR購(gòu)自德國(guó)Bruker PharmaScan公司；小鼠正常飼料D12492、高脂飼料D12450B購(gòu)自博泰宏達(dá)生物有限公司。

2. 實(shí)驗(yàn)方法:(1)肥胖小鼠模型建立及干預(yù):將6周齡清潔級(jí)C57BL6雄性小鼠32只,隨機(jī)分為4組，每組8只，其中一組給予正常飼料(D12450B，10kcal%脂肪)喂養(yǎng)，其余3組給予高脂飼料(D12492，60kcal%脂肪)喂養(yǎng)，進(jìn)行肥胖小鼠造模。8周后，與正常飼料喂養(yǎng)組比較，高脂飼料喂養(yǎng)組平均體質(zhì)量增長(zhǎng)超過(guò)30%，提示肥胖小鼠造模成功。將成功造模后的高脂飼料喂養(yǎng)組隨機(jī)分為利拉魯肽(GLP-1)組、隔日禁食(ADF)組和高脂對(duì)照(HFD)組, GLP-1組和HFD組分別繼續(xù)給予高脂飲食，ADF組與正常對(duì)照(Control)組給予普通飼料喂養(yǎng)。GLP-1組每日皮下注射利拉魯肽 0.4mg/(kg·d)，ADF組為每隔24h給予正常飼料，期間自由飲水。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)鼠籠飼養(yǎng),每籠4～5只,溫度 20～25℃,濕度50%～60%，動(dòng)物室內(nèi)明暗各12h左右。(2)1H-MRS測(cè)定肩胛間區(qū)棕色脂肪、腹股溝區(qū)白色脂肪及肝臟內(nèi)甘油三酯(triglyceride, TG)含量:每組小鼠8只,4組共32只，掃描晨起禁食, 所有1H-MRS采集均在9.4 T MicroMR成像設(shè)備(Bruker PharmaScan，德國(guó))上完成。掃描期間采用吸入麻醉劑異氟烷，與氧氣混合后誘導(dǎo)劑量為5%，維持劑量為1%～2%，同時(shí)連接呼吸門(mén)控監(jiān)視呼吸節(jié)律及幅度，呼吸頻率保持25～35次/分，并予以保溫。采集1H-MRS運(yùn)用點(diǎn)分辨自旋回波波譜技術(shù)(point-resolved echo spin spectroscopy，PRESS)，體素為1.5mm×1.5mm×1.5mm～3.0mm×3.0mm×3.0mm，先取俯臥位，體將表面線圈至于肩胛間區(qū)，再取仰臥位，將表面線圈置于下腹部生殖腺周?chē)案闻K左葉，避開(kāi)大血管部位。波譜數(shù)據(jù)分析時(shí)，設(shè)定4.7ppm位置水峰下面積為1，所有其他峰的積分值都隨之標(biāo)準(zhǔn)化，甘油三酯(triglyceride,TG)峰位于1.2ppm處。按下列公式計(jì)算脂肪含量： TG含量=TG峰下面積/(水峰下面積+TG峰下面積)×100%。

結(jié) 果

1.4組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)比較：干預(yù)前各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠平均體質(zhì)量均呈明顯升高的趨勢(shì)(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。干預(yù)16周末，GLP-1組小鼠平均體質(zhì)量明顯低于HFD組(P=0.009)，而高于對(duì)照組(P=0.011)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組小鼠干預(yù)16周后，ADF組小鼠平均體質(zhì)量最低，詳見(jiàn)圖2、表1。

圖1 4組小鼠造模及干預(yù)期間體質(zhì)量變化

圖2 干預(yù)16周末4組小鼠體質(zhì)量比較

表1 干預(yù)16周末4組小鼠體質(zhì)量及1H-MRS下各部位TG含量比較

與HFD組比較,*P<0.05;與ADF組比較,ΔP<0.05

2.4組小鼠肩胛部棕色脂肪TG平均含量：由低到高分別是對(duì)照組，ADF組，GLP-1組和HFD組；各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1、圖3。

圖3 干預(yù)16周末4組小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪TG含量比較

3.肝臟TG含量：4組小鼠肝臟TG平均含量由低到高分別是對(duì)照組， GLP-1組，ADF組和HFD組，GLP-1組和HFD組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)，詳見(jiàn)表1、圖4。

圖4 干預(yù)16周末4組小鼠肝臟TG含量比較

4.腹股溝部位白色脂肪TG含量：4組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量由低到高分別是對(duì)照組，ADF組， GLP-1組和HFD組，與GLP-1組小鼠比較，對(duì)照組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量明顯降低(P=0.002)，HFD組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量明顯升高(P=0.015)，詳見(jiàn)表1、圖5。

圖5 4組小鼠肝臟部位1H-MRS圖像

圖6 干預(yù)16周末4組小鼠腹股溝區(qū)白色脂肪TG含量比較

討 論

目前隨著全球肥胖人群的不斷增長(zhǎng)，肥胖的預(yù)防和控制越來(lái)越受到人們的關(guān)注。肥胖所引發(fā)的胰島素抵抗、血脂代謝異常、慢性炎性反應(yīng)是其引起的相關(guān)慢性疾病發(fā)生及發(fā)展的重要原因。甘油三酯(TG)在體內(nèi)沉積部位包括脂肪組織與非脂肪組織(如肝臟)兩部分，因此脂肪組織可與肝臟相互聯(lián)系，通過(guò)調(diào)節(jié)游離脂肪酸水平，合成與釋放多種脂肪細(xì)胞因子來(lái)控制全身的脂質(zhì)代謝[16]。

利拉魯肽作為一種人工合成的GLP-1受體激動(dòng)劑，與人體內(nèi)GLP-1的同源性達(dá)97%，目前研究表明人體內(nèi)GLP-1可抑制攝食中樞，延緩胃排空，從而達(dá)到抑制甘油三酯吸收的效果，因此人體內(nèi)GLP-1在減低體重的同時(shí)可改善脂質(zhì)代謝[17]。關(guān)于人工合成GLP-1受體激動(dòng)劑的研究亦表明，GLP-1受體激動(dòng)劑可能通過(guò)抑制脂肪的合成及刺激脂肪酸氧化兩個(gè)方面來(lái)改善肝臟的脂質(zhì)代謝[18]。雖然目前大量研究結(jié)果表明GLP-1可影響體內(nèi)脂肪酸代謝，然而機(jī)制仍未完全明確。

自2010年Gupta等首次發(fā)現(xiàn)人類(lèi)原代肝細(xì)胞上存在GLP-1受體,之后陸續(xù)有臨床、動(dòng)物及細(xì)胞研究證明了GLP-1能改善脂質(zhì)在肝臟內(nèi)的沉積,但具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，作為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因表達(dá)的β-catenin分子對(duì)GLP-1的生成和功能發(fā)揮起著重要作用，其重要機(jī)制除了包括wnt信號(hào)途徑外，還可能與遷移相關(guān)信號(hào)通路PI3K/Akt、MAPKs之間存在密切關(guān)系。β-catenin作為wnt信號(hào)途徑的核心分子，越來(lái)越多的研究表明，其與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病以及代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。雖然GLP-1降脂機(jī)制仍不十分清楚，但其降脂效果得到了公認(rèn)，本研究意在通過(guò)小鼠高脂模型研究GLP-1對(duì)小鼠機(jī)體不同部位脂肪含量的影響，驗(yàn)證其通過(guò)多途徑影響脂代謝的假說(shuō)。

本研究通過(guò)對(duì)C57BL6小鼠建立肥胖模型，以FDA建議的3.0mg/d的減重劑量換算成小鼠給藥劑量0.4mg/(kg·d)，并分別設(shè)置普通對(duì)照組，高脂對(duì)照組及隔日禁食組，隔日禁食組被動(dòng)性減少小鼠攝食量，導(dǎo)致小鼠攝入的能量顯著降低，從而達(dá)到強(qiáng)制性減重的目的。干預(yù)16周末，通過(guò)1H-MRS技術(shù)分別對(duì)4組小鼠進(jìn)行掃描，測(cè)量定量肩胛部位棕色脂肪，腹股溝區(qū)白色脂肪及肝臟等3個(gè)部位的甘油三酯含量。

本研究結(jié)果顯示，利拉魯肽有顯著降低體質(zhì)量及改善白色脂肪脂質(zhì)代謝的作用，但通過(guò)與隔日禁食組比較后發(fā)現(xiàn)，額外的體質(zhì)量減低并沒(méi)有給隔日禁食組帶來(lái)白色脂肪脂質(zhì)代謝方面的獲益，這說(shuō)明利拉魯肽在通過(guò)降低體質(zhì)量改善脂質(zhì)代謝的同時(shí)，還有其他不依賴(lài)于體質(zhì)量減輕而影響脂質(zhì)代謝的途徑。有研究顯示，GLP-1受體激動(dòng)劑可能通過(guò)MAPK通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性，還可能通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬作用，減少肝臟脂肪沉積，并通過(guò)增加沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT1)的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少肝臟脂質(zhì)沉積[19，20]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，哺乳類(lèi)動(dòng)物和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的肝臟上均存在 GLP-l受體[21]。因此，筆者認(rèn)為利拉魯肽改善肝臟脂質(zhì)代謝是一個(gè)多途徑、多通路的復(fù)雜的過(guò)程，不單純依賴(lài)于體重的減輕，但這一過(guò)程還需要更多的基礎(chǔ)性研究加以佐證。