閆 冰 樸松林 楊海燕 元冬梅 沈禹辰 李吉辰

口腔頜面部惡性腫瘤是全球范圍內(nèi)10種最常見的腫瘤之一，其中以口腔鱗狀細胞癌所占比例最高，約為90%以上[1]。在過去的幾十年里，口腔鱗癌的發(fā)生率呈明顯的上升趨勢[2]。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框Q1(forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1)廣泛存在于人體的多種組織和器官，具有促進上皮分化、參與細胞周期調(diào)節(jié)等多種生理功能，并與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關系密切，但目前FOXQ1在口腔鱗癌中的表達情況及作用尚未明確[3]。上皮鈣黏蛋白(epitheia cadherin，E-cadherin)目前被公認為是一類抑癌因子，其表達水平降低或缺失可作為腫瘤細胞出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的一個關鍵性特征，與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移具有相關性[4]。本研究通過免疫組化染色法檢測FOXQ1和E-cadherin的表達情況，分析兩者之間的相關性，探究兩者在口腔鱗癌中的作用及臨床意義。

對象與方法

1.實驗對象:收集2013年4月～2016年10月間哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院病理科已確診的口腔鱗癌組織石蠟標本作為研究對象。根據(jù)WHO病例分型,其中高分化口腔鱗癌51例，中、低分化口腔鱗癌18例，共69例，其中，男性39例，女性30例，患者年齡38～80歲，中位年齡為57歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分類分期標準(2010)對臨床分期進行分類：Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期23例。納入本研究中的所有口腔鱗癌患者均已行手術(shù)治療，且術(shù)前均未接受過放、化療等相關治療。從口腔頜面外科手術(shù)切取的唇、舌、牙齦、頰部及口底來源共32例正常口腔黏膜組織石蠟標本作為對照組。兩組常規(guī)資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本實驗已獲得患者及家屬的知情同意。

2.主要試劑：FOXQ1兔抗人多克隆抗體、E-cadherin兔抗人多克隆抗體、免疫組化試劑盒以及DAB顯示劑盒等均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

3.實驗方法：本實驗應用SP方法，所有標本按4μm厚度作連續(xù)切片。將組織石蠟切片置于67℃烤箱中烤90min，脫蠟，PBS沖洗3min×3次。放置于3%H2O2室溫下孵育10min，PBS 沖洗3min×3次。PBS浸泡5min。將切片浸泡于EDTA緩沖液，高壓蒸汽鍋行抗原修復，待壓力鍋噴氣時，計時3min后于室溫下自然冷卻。PBS沖洗5min×3次。滴加FOXQ1多克隆抗體(1∶100)及E-cadherin多克隆抗體(1∶100)，于4℃恒溫環(huán)境下過夜，蒸餾水沖洗5min 后，PBS沖洗3min×3次；滴加二抗工作液，37℃孵育30min；蒸餾水沖洗3min后，PBS 沖洗3min×3次；DAB試劑盒顯色，蒸餾水沖洗終止顯色反應。蘇木精復染，蒸餾水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

4.結(jié)果判讀：FOXQ1在口腔鱗癌組織中的陽性表達為細胞質(zhì)被染出棕黃色顆粒，少量細胞核中表達。E-cadherin在正?？谇火つそM織中的陽性表達為細胞膜與胞質(zhì)被染出棕黃色顆粒。每張切片高倍鏡下(×400)隨機觀察5個不重疊視野，每個視野各計200個細胞。采用雙盲法，根據(jù)陽性腫瘤細胞率進行半定量分析，陽性細胞率以≤10%、10%～50%(含)、50%～80%、≥80%分別記為0、1、2、3分；根據(jù)染色程度進行評分：無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；結(jié)果按兩者的得分之積來判定結(jié)果：<3分計為陰性(-)，≥3分計為陽性(+)。

5.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗處理計數(shù)資料，Spearman法行等級相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達比較:FOXQ1在口腔鱗癌中的表達位置主要為細胞質(zhì)，可見癌細胞被染成棕黃色至棕褐色，少見細胞核表達，而在正?？谇火つそM織中表現(xiàn)為表達減少甚至缺失。E-cadherin在正?？谇火つそM織中的表達位置主要為細胞膜與細胞質(zhì)中，亦都被染成棕色，而在口腔鱗癌組織中低表達或不表達(圖1)。FOXQ1在口腔鱗癌組織中陽性表達率為71.01%(49/69)，E-cadherin則為27.53%(19/69)，正?？谇火つそM織中陽性表達率分別為18.75% (6/32)、84.37% (27/32)，兩者間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),詳見表1。

圖1 FOXQ1和E-cadherin在口腔鱗癌及正?？谇火つそM織中的表達比較(×400)A.FOXQ1在正?？谇火つそM織中的表達；B.FOXQ1在高分化口腔鱗癌組織中的表達；C.FOXQ1在中分化口腔鱗癌組織中的表達；D.FOXQ1在低分化口腔鱗癌組織中的表達；E.E-cadherin在正?？谇火つそM織中的表達；F.E-cadherin在高分化口腔鱗癌組織中的表達；G.E-cadherin在中分化口腔鱗癌組織中的表達；H.E-cadherin在低分化口腔鱗癌組織中的表達

表1 FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌及正?？谇火つそM織中的表達

與正?？谇火つそM織比較，*P<0.01

2.口腔鱗癌組織中FOXQ1及E-cadherin的表達與臨床病理參數(shù)的關系:在口腔鱗癌組織中，F(xiàn)OXQ1的表達與患者的年齡、性別、吸煙史及腫瘤直徑無明顯相關性(P>0.05)，與口腔鱗癌的組織分化程度及TNM分期呈正相關(P<0.05)，E-cadherin的表達與上述結(jié)論一致，詳見表2。

表2 FOXQ1與E-cadherin的表達與口腔鱗癌臨床病理參數(shù)的關系

3.口腔鱗癌組織中FOXQ1與E-cadherin表達的相關性:FOXQ1陽性表達的49例口腔鱗癌組織標本中，E-cadherin陽性表達為10例，陰性表達為39例；FOXQ1陰性表達的20例口腔鱗癌組織標本中，E-cadherin陽性表達為9例，陰性表達為11例。以Spearman法行等級相關性分析，口腔鱗癌組織中FOXQ1與E-cadherin的表達呈明顯負相關(r=-0.250，P<0.05),詳見表3。

討 論

FOXQ1屬于叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。FOXQ1基因位于人類染色體6p25.3，由2319個堿基對(bp)組成，F(xiàn)OXQ1蛋白含有403個功能氨基酸[11]。FOXQ1通過作用于靶基因啟動子區(qū)域的GC盒等核心元件，影響基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮生物學效應。以往的研究證實FOXQ1的過度表達與肝細胞癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和食管鱗癌等多種癌癥的不良預后和遠處轉(zhuǎn)移密切相關[12～17]。Gao等[18]以FOXQ1高表達的人卵巢癌細胞系SKOV3為模型，利用shRNA敲除方法沉默F(xiàn)OXQ1的表達后發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)節(jié)因子的表達受到影響，并使上皮細胞標志物上調(diào)、間充質(zhì)細胞標志物下調(diào)，導致其腫瘤細胞生長周期出現(xiàn)減緩現(xiàn)象，從而抑制細胞增殖，減少細胞運動與侵襲，這些結(jié)果提示FOXQ1的表達對維持卵巢癌細胞的增殖、運動、侵襲和EMT是必不可少的。

表3 FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌組織中表達的相關性

Zhang等[19]和Fan等[20]研究發(fā)現(xiàn),FOXQ1的異位表達促進了細胞在體外的遷移和侵襲，增強了乳腺上皮細胞在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移，并觸發(fā)了明顯的EMT，其作用機制可能為FOXQ1蛋白直接作用于E-cadherin的啟動子區(qū)域，從而抑制E-cadherin的表達，并參與了TGF-b1誘導的EMT過程。Qiao等[21]研究發(fā)現(xiàn)FOXQ1在多種結(jié)腸癌細胞株中的異位表達不僅能誘導EMT的發(fā)生，并能誘導這些細胞產(chǎn)生化療藥物耐藥性。Zhan等[22]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1在胰腺癌組織中的表達上調(diào)，其主要在胰腺癌細胞質(zhì)中表達，在細胞核中表達較少。胰腺癌組織中FOXQ1表達水平顯著高于癌旁組織，并與腫瘤分化程度呈正相關，這也與筆者的實驗結(jié)果相一致。本研究中FOXQ1在口腔鱗癌組的陽性表達率與對照組差異有統(tǒng)計學意義(71.01%、18.75%，P<0.01)，初步推斷FOXQ1在口腔鱗癌中扮演著重要角色。FOXQ1與口腔鱗癌的組織分化程度及TNM分期相關則提示其在口腔癌的發(fā)展中起到一定作用。

腫瘤細胞向遠處器官轉(zhuǎn)移是人類腫瘤最常見的死亡原因。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一個促進細胞遷移和侵襲的動態(tài)過程。上皮細胞可喪失極性轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型，細胞黏附性連接中斷，從而使腫瘤細胞具備了遷移和侵襲能力，引起腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移[5]。因此，EMT相關轉(zhuǎn)移是腫瘤研究的一個重要領域。E-cadherin是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，其N-端位于細胞外而C-端位于細胞內(nèi)，其編碼基因(CDH1)位于人類染色體6q22.1[6，7]。E-cadherin可以介導同種上皮細胞之間的黏附作用，起著維持上皮組織結(jié)構(gòu)完整的重要作用[8]。如果E-cadherin在組織中失活或是表達水平降低，細胞間的黏附力會明顯下降，進而有利于腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。反之，若E-cadherin 在組織中的表達水平升高可增強細胞間的黏附，腫瘤細胞的侵襲力被減弱，抑制其浸潤轉(zhuǎn)移[9]。EMT的一個標志性特征是E-cadherin的表達抑制，E-cadherin也被認為是EMT的關鍵開關[10]。本研究中E-cadherin在正常黏膜組織中的陽性表達率為84.37%，但僅有27.53%口腔鱗癌標本呈陽性表達，兩者之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示E-cadherin與口腔鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有關。

綜上所述，在口腔鱗癌的發(fā)病過程中，F(xiàn)OXQ1呈高表達水平，而E-cadherin的表達情況則呈相反趨勢，二者呈明顯負相關(r=-0.250，P<0.05)，F(xiàn)OXQ1與E-cadherin共同參與口腔鱗癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，F(xiàn)OXQ1與E-cadherin的聯(lián)合檢測可作為口腔鱗癌早期診斷及判斷預后的生物學指標，F(xiàn)OXQ1有望成為口腔鱗癌治療的新靶點。但FOXQ1和E-cadherin二者在口腔鱗癌中的作用機制尚需開展進一步探究。