劉小慧 賀曼曼 張 偉 李 靜 郭明海 馮運(yùn)章

胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，起病隱匿，80%以上的胃癌患者被診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，單純手術(shù)治療預(yù)后不理想[1]。目前進(jìn)展期胃癌已形成以手術(shù)為主，聯(lián)合化療、放療、靶向、免疫等措施的綜合治療模式。新輔助化療、轉(zhuǎn)化治療或術(shù)后輔助化療均能改善部分患者總體生存期[2]。奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)是胃癌化療核心藥物,但臨床上常見到對其耐藥的患者[3,4]。胃癌異質(zhì)性極強(qiáng)，一旦腫瘤細(xì)胞耐藥嚴(yán)重影響化療效果，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞耐藥意義重大，而體外建立耐藥細(xì)胞系是研究細(xì)胞耐藥的重要模型?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor- 1，SDF-1)是一種炎性趨化因子，與其特異性受體CXCR4結(jié)合后參與介導(dǎo)炎性和免疫反應(yīng)、調(diào)控造血、血管生成、惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程[5]。目前有研究報(bào)道SDF-1高表達(dá)與白血病、卵巢癌、肺癌細(xì)胞化療耐藥密切相關(guān)[6～8]。但胃癌細(xì)胞耐藥中SDF-1是否發(fā)揮作用鮮有報(bào)道。因此本研究旨在誘導(dǎo)建立對L-OHP耐藥的胃癌細(xì)胞系SGC7901/L-OHP，觀察其生物學(xué)行為變化，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默SDF-1基因表達(dá)，探討SDF-1基因?qū)ξ赴┠退幖?xì)胞系SGC7901/L-OHP增殖、凋亡、耐藥的影響及可能機(jī)制。

材料與方法

1.材料:(1)細(xì)胞株：胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。(2)主要試劑、藥物：兔抗人SDF-1單克隆體抗(Abcam公司，ab155090)；轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine-2000、Trizol Reagent(美國 Invitrogen 公司)；cDNA 合成試劑盒(美國Fermentas公司)；全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)；MTT試劑盒、溴化乙錠(美國Sigma公司)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)PCR引物均由上海生物工程有限公司合成；SDF-1小干擾RNA質(zhì)粒由上海吉瑪制藥有限公司合成。奧沙利鉑(50毫克/支，武漢醫(yī)藥有限公司)。

2.奧沙利鉑耐藥胃癌細(xì)胞系的誘導(dǎo)構(gòu)建及生物學(xué)行為變化:(1)奧沙利鉑耐藥胃癌細(xì)胞系的構(gòu)建與評(píng)定:人胃癌細(xì)胞株SGC7901常規(guī)培養(yǎng)傳代。采用高濃度間歇沖擊誘導(dǎo)法：預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測SGC7901細(xì)胞IC50約為10μg/ml，取對數(shù)生長期細(xì)胞與1μg/ml(1/10 IC50)的L-OHP在培養(yǎng)箱共孵育24h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞恢復(fù)生長后，增加藥量為2μg/ml(1/5 IC50)，重復(fù)上述步驟，根據(jù)存活耐藥細(xì)胞恢復(fù)對數(shù)生長的時(shí)間，間歇縮短給藥時(shí)間并增大藥物濃度，分別為5、10、20、40、80μg/ml，歷時(shí)5.5個(gè)月，最終誘導(dǎo)能在10μg/ml的L-OHP共培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的細(xì)胞，MTT檢測并計(jì)算其耐藥指數(shù)(resistance index，RI)為5.5，經(jīng)多次冷凍復(fù)蘇其耐藥指數(shù)均較為恒定，命名為SGC7901/L-OHP。下述實(shí)驗(yàn)開展前細(xì)胞均脫藥培養(yǎng)2周。(2)觀察SGC7901/L-OHP形態(tài)學(xué)變化:①倒置顯微鏡觀察：SGC7901與SGC7901/L-OHP收集接種至24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后倒置顯微鏡拍照觀察；②透射電鏡觀察：收集兩種細(xì)胞，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色，透射電鏡拍照觀察。(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線：取對數(shù)生長期的細(xì)胞約2×104個(gè)，培養(yǎng)于24孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔細(xì)胞數(shù)，取平均值，共觀察6天，繪制細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算兩種細(xì)胞群體倍增時(shí)間(TD)。(4)MMT法檢測L-OHP對SGC7901、SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖的影響：各取對數(shù)期細(xì)胞約2×104個(gè)，培養(yǎng)于96孔板，24h后分別按照L-OHP(1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/ml)濃度梯度加藥，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后每孔加入MTT溶液(濃度5mg/ml)20μl，37℃培養(yǎng)4h，棄上清, 加100μl的DMSO，自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔570nm波長吸光度值，分別計(jì)算兩種細(xì)胞增殖抑制率[增殖抑制率=(1-用藥組A/對照組A)×100%]。SPSS軟件計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC7901與SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期變化:各取對數(shù)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，離心，棄上清，PBS洗滌，70%乙醇固定，4℃過夜，PBS洗滌3次，再離心，棄上清及乙醇，加碘化丙啶染液500μl，4℃避光反應(yīng)30min，上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。(6)RT-PCR檢測SDF-1 mRNA表達(dá):按2×107收集對數(shù)期兩種細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置25μl反應(yīng)體系擴(kuò)增目的基因。引物序列：SDF-1,上游引物(5′→3′):GGGTACCATGCAGCTTGTTG；下游引物(5′→3′):GAGATCTCTAGGCGCCCTGG。GAPDH,上游引物(5′→3′): AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；下游引物(5′→3′):AGGGGCCATCCACAGTCTTC。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min→94℃變性30s→(SDF-1，55℃；GAPDH，58℃)退火60s→72℃延伸1min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。SDF-1 mRNA相對表達(dá)強(qiáng)度=IOD(SDF-1)/IOD(GAPDH)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。(7)Western blot法檢測SDF-1蛋白表達(dá)：分別收集2×107個(gè)細(xì)胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，50μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。20ml封閉液室溫?fù)u床孵育1.5h,棄封閉液，一抗孵育(兔抗人SDF-1單抗)，4℃孵育過夜后洗膜，按1∶3000稀釋倍數(shù)加入辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1.5h。洗膜后用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算SDF-1蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染后SGC7901/L-OHP生物學(xué)行為的變化:(1)SDF-1-RNAi的合成、實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染:SDF-1-RNAi由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，其序列(5′→3′)：GTGCATTGACCCGAAGCTAAATCAAGAGTTTAGCTTCGGGTCAATG-CACTTTTT。非特異性序列(5′→3′)：GATCCGAC-GAGTTGACTGCGATTGTTCAAGAGACAATCGCAGTC-AACTCGTCGTCAGA。實(shí)驗(yàn)分3組，即空白對照組(細(xì)胞不經(jīng)任何處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染非特異性序列質(zhì)粒)和SDF-1-RNAi組(轉(zhuǎn)染SDF-1-RNAi質(zhì)粒)。細(xì)胞接種于6孔板，融合度80%左右時(shí)通過Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。(2)RT-PCR、Western blot法檢測SDF-1表達(dá)情況:RT-PCR及Western blot法具體實(shí)驗(yàn)步驟同前，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞SDF-1 mRNA和蛋白表達(dá)，驗(yàn)證沉默效果。(3)MTT法檢測3組細(xì)胞增殖抑制率變化:MTT實(shí)驗(yàn)步驟同前，檢測轉(zhuǎn)染后48h 3組細(xì)胞增殖及耐藥性變化。(4)流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化:具體操作同前，凋亡率檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及周期分布。

結(jié) 果

1.SGC7901/L-OHP形態(tài)學(xué)改變:5.5個(gè)月后成功誘導(dǎo)建立SGC7901/L-OHP，倒置顯微鏡下觀察，與親本細(xì)胞比較，最終建立的耐藥細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，變細(xì)變長，可見梭形、長條形、三角形細(xì)胞，并可見較多漂浮細(xì)胞，生長分布比較均勻，聚集生長現(xiàn)象不明顯(圖1)。透射電鏡下觀察SGC7901細(xì)胞核清晰，核仁明顯，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，表面見豐富微絨毛。SGC7901/L-OHP細(xì)胞核相對增大，細(xì)胞質(zhì)空泡結(jié)構(gòu)明顯增多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面微絨毛較少(圖2)。

圖1 SGC7901和SGC7901/L-OHP倒置顯微鏡觀察A.SGC7901(×100)；B.SGC7901(×200)；C.SGC7901/L-OHP(×100)；D.SGC7901/L-OHP(×200)

圖2 SGC7901和SGC7901/L-OHP透射電鏡觀察A.SGC7901(×5000)；B.SGC7901/L-OHP(×5000)

2.SGC7901/L-OHP生長曲線及倍增時(shí)間：細(xì)胞計(jì)數(shù)法記錄兩種細(xì)胞每日細(xì)胞數(shù)，以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制生長曲線(圖3)。經(jīng)公式計(jì)算SGC7901與SGC7901/L-OHP的群體倍增時(shí)間分別為23.56±1.44h、27.83±1.67h。與SGC7901比較，SGC7901/L-OHP群體倍增時(shí)間明顯延長(P<0.05)，耐藥細(xì)胞增殖明顯減慢。

圖3 SGC7901和GC7901/L-OHP細(xì)胞生長曲線

3.SGC7901/L-OHP對L-OHP的耐藥性變化：由圖4可見，隨著L-OHP濃度的升高，兩種細(xì)胞增殖抑制率均明顯升高，但在L-OHP相同濃度下，SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率明顯低于SGC7901(P均<0.05)。SGC7901的IC50為10.424±1.193μg/ml，SGC7901/L-OHP IC50為57.405±2.158μg/ml，RI為5.5。Snow等研究認(rèn)為，細(xì)胞耐藥分為低度耐藥(RI<5)、中度耐藥(RI 5～15)和高度耐藥(RI>15)。依此標(biāo)準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)成功建立中度耐藥細(xì)胞系SGC7901/L-OHP,且多次冷凍復(fù)蘇后復(fù)測耐藥指數(shù)恒定。

圖4 奧沙利鉑對SGC7901與SGC7901/L-OHP的細(xì)胞抑制率比較與SGC7901比較，*P<0.05

4.SGC7901與SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期分布情況:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與SGC7901比較，SGC7901/L-OHP的G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，S期細(xì)胞比例顯著減低(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例無變化(P>0.05，表1，圖5)。

表1 SGC7901與SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期分布

與SGC7901比較，*P<0.05

圖5 SGC7901與SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期分布

5.SGC7901與SGC7901/L-OHP中SDF-1表達(dá)情況:RT-PCR結(jié)果顯示，SGC7901/L-OHP細(xì)胞中SDF-1 mRNA的表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞(1.367±0.173 vs 0.750±0.104,t=6.833,P<0.01)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，SGC7901/L-OHP細(xì)胞中SDF-1蛋白的表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞(1.647±0.220 vs 1.255±0.158,t=3.226,P<0.05,圖6)。

圖6 兩種細(xì)胞株中SDF-1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況a.SGC7901；b.SGC7901/L-OHP

6.SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染后SDF-1的表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染48h后，空白對照組、陰性對照組、SDF-1-RNAi組SDF-1 mRNA表達(dá)量分別為1.367±0.178、1.336±0.225、0.328±0.035，轉(zhuǎn)染組與空白、陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.843，P<0.01)，空白與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明siRNA-SDF-1成功沉默了SDF-1 mRNA的表達(dá)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組、SDF-1-RNAi組SDF-1蛋白表達(dá)量分別為1.655±0.282、1.583±0.263、0.242±0.024，SDF-1-RNAi組與空白、陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.147，P<0.01)，空白與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從蛋白水平也印證了siRNA-SDF-1成功沉默了SDF-1蛋白的表達(dá)(圖7)。

圖7 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞SDF-1 mRNA和蛋白表達(dá)情況A.空白對照組；B.陰性對照組；C.SDF-1-RNAi組

7.SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染后SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率及化療敏感度變化：轉(zhuǎn)染48h后MTT檢測結(jié)果顯示，隨著L-OHP濃度的遞增，3組細(xì)胞的增殖抑制率均明顯升高。在L-OHP相同濃度下，SDF-1-RNAi組細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于空白、陰性對照組(P均<0.05)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默SDF-1后SGC7901/L-OHP增殖受到明顯抑制。同時(shí)，SDF-1-RNAi組IC50(20.512±1.666)明顯低于空白及陰性對照組(55.565±2.345，53.030±2.458，P<0.05)，耐藥指數(shù)明顯降低(圖8)。

圖8 奧沙利鉑對各組細(xì)胞增殖抑制率的比較與空白、陰性對照組比較，*P<0.05

8.SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染后SGC7901/L-OHP細(xì)胞凋亡率的變化:轉(zhuǎn)染48h后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，SDF-1-RNAi組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白及陰性對照組(P均<0.05)，空白對照組與陰性對照組凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 3組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布的比較

與空白、陰性對照組比較，*P<0.05

9.SDF-1-RNAi轉(zhuǎn)染后SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期分布變化:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(表2，圖9)顯示，與空白及陰性對照組比較，SDF-1-RNAi組細(xì)胞被阻滯于S期，S期細(xì)胞比例顯著增加(F=17.584，P<0.01)，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(F=37.193，P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例無變化(F=0.822，P>0.05)。空白對照組與陰性對照組比較，各期細(xì)胞比例均衡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖9 流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布A.空白對照組；B.陰性對照組；C.SDF-1-RNAi組

討 論

我國胃癌發(fā)生率位居惡性腫瘤第4位，病死率居第2位,其中約90%發(fā)現(xiàn)時(shí)已到進(jìn)展期，即使手術(shù)治療,5年生存率仍低于30%[9,10]。擴(kuò)大手術(shù)切除范圍和術(shù)后輔助化療依舊是提高胃癌術(shù)后生存率的主要手段[11]。XELOX方案或SOX方案是胃癌一線化療方案，核心藥物均包含奧沙利鉑。奧沙利鉑通過鉑原子與DNA形成鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)及蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而損傷DNA[3]。然而在治愈腫瘤或顯著延長患者生存期方面，化療效果并不理想，化療過程中存活腫瘤細(xì)胞的再增殖及腫瘤細(xì)胞的耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵[12]。有鑒于此，對腫瘤細(xì)胞耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥的研究始終是一種熱潮。體外建立耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤耐藥的基礎(chǔ)，通常采用低濃度持續(xù)誘導(dǎo)和高濃度間歇沖擊兩種方法構(gòu)建。

李彩麗等[13]分別采用上述兩種方法誘導(dǎo)建立大腸癌耐藥細(xì)胞系SW480/OXP，認(rèn)為高濃度間歇沖擊法具有誘導(dǎo)時(shí)相短以及構(gòu)建的細(xì)胞系耐藥性更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此本研究采用大劑量間歇沖擊誘導(dǎo)法，歷時(shí)5.5個(gè)月成功建立人胃癌奧沙利鉑中度耐藥細(xì)胞系SGC7901/L-OXP。從光鏡下觀察，與SGC7901細(xì)胞比較，SGC7901/L-OXP細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞細(xì)長，可見梭形、長條形、三角形細(xì)胞。文俏程等[14]研究認(rèn)為SGC7901/L-OXP細(xì)胞的這種形態(tài)改變屬于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT可能是人胃癌細(xì)胞對 L-OHP 產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制。生長曲線分析顯示SGC7901/L-OXP細(xì)胞增殖變緩，倍增時(shí)間較SGC7901細(xì)胞延長約4h。而細(xì)胞倍增時(shí)間越長其對化療藥物越不敏感[15]。MTT結(jié)果顯示在L-OHP相同濃度作用下，SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率明顯低于SGC7901，表明耐藥細(xì)胞對L-OHP藥物敏感度明顯降低。同時(shí)，與SGC7901細(xì)胞比較，SGC7901/L-OHP細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，G0/G1期細(xì)胞升高，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞無變化。一般的化療藥物只對增殖期細(xì)胞敏感，對G0期細(xì)胞效果相對較差[9]，這可能是人胃癌SGC7901細(xì)胞對 L-OHP 產(chǎn)生耐藥的另一個(gè)重要原因。

SDF-1是一種炎性趨化因子，與其配體 CXCR4 廣泛表達(dá)于人體多種細(xì)胞和組織，在白血病、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥中均發(fā)揮重要作用[6～8]。SDF-1能夠誘導(dǎo)ERK磷酸化,上調(diào)Bcl-xL的表達(dá)進(jìn)而降低ALL細(xì)胞株SUP-B15對阿霉素的敏感度,保護(hù)白血病細(xì)胞耐受化療[6]。SDF-1能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與克隆，提高其同源重組修復(fù)能力，介導(dǎo)順鉑耐藥[7]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌SDF-1提高Bcl-xL的表達(dá)，增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞對順鉑的耐藥性[8]。此外，沈照華等[16]發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸能促使白血病成骨龕基質(zhì)細(xì)胞層包裹白血病細(xì)胞形成“庇護(hù)所”樣結(jié)構(gòu)，促使白血病細(xì)胞滯留于靜止期，屏蔽阿糖胞苷的殺傷，而阻斷SDF-1/CXCR4軸活性后，靜止期細(xì)胞脫離成骨龕，對化療藥物敏感度增加，細(xì)胞凋亡增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SGC7901/L-OHP細(xì)胞中SDF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞，提示SDF-1高表達(dá)參與了SGC7901對L-OHP獲得性耐藥過程。應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默SDF-1表達(dá)后，SDF-1-RNAi組細(xì)胞SDF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著低于空白、陰性對照組，表明SDF-1-RNAi能夠有效沉默SDF-1基因。在此基礎(chǔ)上MTT結(jié)果顯示，在相同L-OHP濃度作用下，SDF-1-RNAi組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空白及陰性對照組，且其IC50值明顯降低，表明沉默SDF-1能夠有效抑制SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖，提高其對L-OHP的藥物敏感度，部分逆轉(zhuǎn)耐藥。目前研究認(rèn)為EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移耐藥均有關(guān)聯(lián)，而SDF-1對EMT具有正向促進(jìn)作用[17～20]。SDF-1高表達(dá)能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞、膽管癌RBE細(xì)胞EMT進(jìn)程，促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移[18，19]。

SDF-1可以通過MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-251 細(xì)胞Survivin基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)EMT[20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，SDF-1能促進(jìn)G0/G1期兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，促進(jìn)其體外增殖并抑制凋亡[21]。本實(shí)驗(yàn)沉默SDF-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，SDF-1-RNAi組細(xì)胞增殖受限，凋亡率增加，且細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，細(xì)胞周期阻滯于S期。由此推測SDF-1促進(jìn)SGC7901/L-OHP細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)可能位于S期進(jìn)入G2/M期的“關(guān)卡”上，當(dāng)沉默SDF-1表達(dá)后細(xì)胞阻滯于S期，細(xì)胞增殖受限，并可能通過抑制Survivin、Bcl-xL的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。同時(shí)SDF-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞EMT進(jìn)程受阻，G0/G1期細(xì)胞失去間質(zhì)化細(xì)胞的“庇護(hù)”，進(jìn)入S期，在L-OHP的作用下大量壞死，從而提高了L-OHP的藥物敏感度。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了人胃癌奧沙利鉑中度耐藥細(xì)胞系SGC7901/L-OHP，并通過RNAi技術(shù)沉默SDF-1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞對L-OHP的敏感度，部分逆轉(zhuǎn)耐藥性。今后SDF-1有望成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的一個(gè)靶點(diǎn)。