張馨予 李娜娜 趙鳴雁 康 凱

膿毒癥(sepsis)是由感染導(dǎo)致的一類機(jī)體炎性反應(yīng)，反映了感染后的全身炎性綜合征[1]。膿毒癥是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因之一，全球每年約有1800萬(wàn)病例，隨著重癥監(jiān)護(hù)病房救治技術(shù)的進(jìn)步，患者病死率雖然已顯著下降，但仍高達(dá)20%～48%[2]。導(dǎo)致患者死亡的原因是多器官衰竭。肝臟可以清除細(xì)菌并對(duì)炎性介質(zhì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，是膿毒癥最易損傷的器官之一。早期研究認(rèn)為，在膿毒癥導(dǎo)致的肝功能障礙中，黃疸和高膽紅素血癥為疾病的晚期表現(xiàn)，目前研究認(rèn)為，肝功能的損傷常發(fā)生在早期[3]。膿毒癥肝損傷根據(jù)發(fā)病機(jī)制分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，原發(fā)性肝損傷主要是由于缺血及再灌注致肝細(xì)胞缺血缺氧性損傷為主，繼發(fā)性肝損傷主要由于炎性因子及感染內(nèi)毒素導(dǎo)致的炎性損傷為主[4]。目前研究認(rèn)為，膿毒癥相關(guān)的肝功能障礙主要是由全身或微循環(huán)障礙、細(xì)菌和內(nèi)毒素(脂多糖)移位以及隨后炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)的激活引起的[5～7]。然而，膿毒癥合并肝損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，各因素之間可以相互影響相互作用，目前對(duì)這一疾病的病理生理機(jī)制仍處于研究探索中。

近年來(lái)，過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR) 在炎性反應(yīng)中的作用逐漸被人們重視[8，9]。PPAR包括 PPAR-α、PPAR-β和 PPAR-γ 3種亞型[10]。當(dāng)前研究表明，PPARs 在細(xì)胞能量代謝、增殖凋亡、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，目前研究較多的是 PPAR-α和PPAR-γ[11～13]。既往文獻(xiàn)表明，PPAR-γ能夠減輕膿毒癥大鼠肝損傷[14]。同時(shí)，有研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PPAR-β內(nèi)源性激動(dòng)劑能明顯增加 PPAR-β表達(dá)，可以通過(guò)抑制環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，減少氧自由基的釋放，從而減少肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷[15]。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道PPAR-β是NF-κB 上游效應(yīng)分子，能夠通過(guò)抑制 NF-κB 的活化，從而減低 LPS介導(dǎo)的TNF-α和 IL-1β介導(dǎo)的PGE2 的表達(dá)。由此認(rèn)為，PPAR-β具有抑制炎性反應(yīng)及抗凋亡作用[16]。目前，關(guān)于 PPAR-β在膿毒癥中的相關(guān)研究報(bào)道極為有限，尚無(wú)深入的機(jī)制研究。

本實(shí)驗(yàn)采用LPS制備最符合臨床膿毒癥患者病理生理過(guò)程的膿毒癥動(dòng)物模型，觀察膿毒癥對(duì)肝的影響，并通過(guò)腹腔注射選擇性激動(dòng)劑GW0742 和抑制劑GSK0660進(jìn)行干預(yù)，觀察PPAR-β能否在膿毒癥小鼠的肝組織發(fā)揮保護(hù)作用，探討PPAR-β在膿毒癥肝損傷中能否抑制環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，減少線粒體氧自由基的釋放，從而起到抗炎、抗氧化和抗凋亡的保護(hù)作用，有望為膿毒癥肝損傷的防治提供新的治療靶點(diǎn)，提供新的靶向治療藥物。

材料與方法

1.材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)雄性 C57/BL 小鼠 8～10 周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，用于實(shí)驗(yàn)的小鼠體質(zhì)量約為20～30g。(2)主要儀器和試劑：0412-1型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海手術(shù)器械廠，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司，PPAR-β激動(dòng)劑GW0742 和抑制劑GSK0660購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，小鼠源單克隆抗體IL-1β、IL-18、TNF-α、capase-1、NF-κB購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司，小鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒、β-actin 小鼠源單克隆抗體、羊抗小鼠免疫球蛋白G辣根過(guò)氧化物酶(immunoglobulin-horseradish peroxidase，IgGHRP)，二抗均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物工程有限公司。

2.方法：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：120只SPF級(jí)雄性小鼠隨機(jī)分為假手?jǐn)?shù)組(SHAM)、膿毒癥肝損傷組(LPS)、肝損傷+激動(dòng)劑組(LPS+GW0742)、肝損傷+抑制劑組(LPS+GSK0660)，每組均為30只。每組小鼠于造模后再按6、12、24h 3個(gè)時(shí)間分為3個(gè)亞組,每組各10只。(2)膿毒癥小鼠肝損傷模型建立：SPF級(jí)小鼠在實(shí)驗(yàn)前12h開始禁食，實(shí)驗(yàn)前4h禁水。實(shí)驗(yàn)前稱體質(zhì)量，Sham組于造模前1h腹腔注射200μl生理鹽水,LPS組腹腔注射LPS 5mg/kg(等滲氯化鈉溶液稀釋至1ml)，LPS+GW0742組和LPS+GSK0660組分別于造模前1.5h腹腔注射GW0742和GSK0660，相應(yīng)的劑量參照以往研究分別設(shè)定為0.3mg/kg和1mg/kg[17]。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)之前死亡的小鼠被排除在研究之外。3組小鼠分別于造模后6、12、24h予10%水合氯醛腹腔注射實(shí)行麻醉(3.5ml/kg)。麻醉滿意后，固定于仰臥位,于腹正中線行1.5～2.0cm的縱行切口,充分暴露腹部，取心臟血及小鼠肝組織。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。 (3)血標(biāo)本采集:充分暴露胸部后，以1ml注射器緩慢抽血，收集血液試管為枸櫞酸抗凝試管,靜置 15min(至于冰塊中),再離心(5000r/min)3min,取上清液,分裝做好標(biāo)記, -80℃冰箱保存,待行血清肝功能檢測(cè)。(4)組織標(biāo)本采集:小鼠處死后,打開腹腔,游離肝臟并取出,取出的肝臟分為兩部分,1份-80℃冰箱保存,另1份置入4%多聚甲醛溶液中固定12h以上,然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，并行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色,觀察病理組織學(xué)改變。

3.檢測(cè)方法：(1)小鼠血清指標(biāo)檢測(cè)：取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中ALT、TBIL 和AST的濃度值。 (2)小鼠肝臟病理切片：小鼠肝臟組織浸泡于甲醛溶液中固定24h后，將肝臟組織切至3mm，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟等過(guò)程，放置于石蠟包埋盒中包埋，包埋后切片，厚度約為6μm，烘烤約2h，置于室溫過(guò)夜。石蠟切片經(jīng)過(guò)軟化、脫蠟、組織軟化、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水、透明后封片。HE染色切片應(yīng)用 BI-2000多功能病理圖像分析系統(tǒng)放大不同倍數(shù)觀察其病理變化。 (3)ELISA 法測(cè)定小鼠肝組織 IL-1β、IL-18、TNF-α水平：取 0.1g肝組織，置于冰上剪碎，加入PBS液600μl，再加入PMSF液6μl，低溫勻漿，3000r/min離心20min，取上清液并做好標(biāo)記。依次將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，將10μl標(biāo)準(zhǔn)品和40μl樣品稀釋液先后加入預(yù)先設(shè)計(jì)的孔中，加入由過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體50μl上述孔中，孵育60min。倒掉上層液體，吸干，反復(fù)洗滌(5次)，在所有孔中各加入50μl A、B，37℃避光孵育15min。最后加入終止液50μl，通過(guò)連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 處吸光度值，再根據(jù)計(jì)算公式得出實(shí)際樣品濃度。(4)Western blot法測(cè)定小鼠肝組織蛋白(IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1、NF-κB)水平:取0.003g肝組織，加入1ml RIPA裂解液、10μl PMSF,置于冰上剪碎組織，勻漿后使用振蕩器震蕩6次(5min 1次，每次20s),12000r/min離心10 min，取上清液并做好標(biāo)記。取96孔酶標(biāo)板，配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，按照濃度梯度依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液、200μl BCA試劑、20μl待測(cè)蛋白,37℃孵育箱孵育30min，在酶標(biāo)儀上590nm處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白濃度，并根據(jù)樣品體積和稀釋度計(jì)算原來(lái)樣品中的蛋白量。取上清液120μl，加入30μl SDS-PAGE,振蕩搖勻后煮沸10min。經(jīng)過(guò)制膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入小鼠源單克隆抗體IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1、NF-κB 5μl 和β-actin小鼠源單克隆抗體17μl，置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日漂洗后加入(兔抗小鼠)IgG-HRP 二抗2μl并放置于4℃冰箱中2h以上準(zhǔn)備曝光。曝光前加入配置好的化學(xué)發(fā)光試劑，利用化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定蛋白及β-actin蛋白灰度值，保存圖片及數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

1.各組小鼠生存率比較:于造模后6、12、24h觀察各組小鼠有無(wú)異常反應(yīng)，4組小鼠均無(wú)死亡，Sham組小鼠未見異常反應(yīng)；LPS組及LPS+GSK0660組中小鼠出現(xiàn)不同程度的精神不振、萎靡、少動(dòng)、蜷縮、發(fā)抖、嗜睡、進(jìn)食減少或拒食等情況；LPS+GW0742組小鼠6、12h時(shí)出現(xiàn)不同程度的精神不振，24h精神較前好轉(zhuǎn)。

2.各組小鼠血清指標(biāo)比較:為檢測(cè)PPAR-β對(duì)膿毒癥肝損傷的保護(hù)作用，將4組小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平的進(jìn)行比較。與Sham組比較，LPS組小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與LPS組小鼠比較，LPS+GW0742組小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。與LPS組小鼠比較，LPS+GSK0660組小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)將4組小鼠不同時(shí)間段血清指標(biāo)分別進(jìn)行比較，Sham組3個(gè)時(shí)間段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS組、LPS+GW0742組、LPS+GSK0660組從6h開始，ALT、AST和TBIL水平顯著升高，12h達(dá)到高峰，24h水平逐漸減低,詳見表1，圖1～圖3。

表1 各組小鼠血清不同時(shí)間ALT、AST和TBIL比較

ALT.谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶；AST.天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；TBIL.總膽紅素(bilirubin)；LPS.膿毒癥肝損傷；LPS+GW0742.膿毒癥肝損傷+激動(dòng)劑；LPS+GSK0660.膿毒癥肝損傷+抑制劑

圖1 血清ALT水平變化

圖2 血清AST水平變化

圖3 血清TBIL水平變化

3.各組小鼠肝組織病理切片比較:如圖4所示，與Sham組比較，LPS組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞間隙模糊、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞腫脹、水樣變性以及肝細(xì)胞再生；LPS+GW0742組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞腫脹、壞死減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；LPS+GW0660組肝臟病理變化與LPS組基本相同。

4.各組小鼠炎性指標(biāo)水平比較

(1)采用ELISA法，檢測(cè)肝組織勻漿的上清液中炎性指標(biāo)TNF-α、IL-1β、IL-18水平：以判斷PPAR-β對(duì)膿毒癥肝損傷是否有保護(hù)作用。與Sham組比較，LPS組小鼠肝組織勻漿的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS組小鼠比較，LPS+GW0742組小鼠肝組織勻漿的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+GSK0660組小鼠肝組織勻漿的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平無(wú)顯著變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖5～圖7。

圖4 肝臟病理變化(HE,×40)

圖5 TNF-α水平變化

圖6 IL-1β水平變化

圖7 IL-18水平變化

(2)各組小鼠肝臟蛋白表達(dá)情況:采用Western blot 法檢測(cè)各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-18、caspase-1、NF-κB水平，以判斷PPAR-β對(duì)膿毒癥肝損傷是否有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥肝損傷最為嚴(yán)重的12h為主，在4組小鼠中，LPS組電泳條帶面積較Sham組增大；LPS+GW0742組條帶面積較LPS組減少；LPS+GSK0660組條帶面積與LPS組無(wú)明顯差距,詳見圖8。在12h,Sham組可見少量TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB蛋白表達(dá)；LPS組TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB蛋白表達(dá)含量均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；LPS+GW0742組蛋白含量表達(dá)低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；LPS+GSK0660組蛋白含量表達(dá)與LPS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。

圖8 各組小鼠蛋白表達(dá)含量情況比較1.假手術(shù)組；2.LPS組；3.LPS+GW0742組；4.LPS+GSK0660組

表2 各組小鼠蛋白情況表達(dá)情況比較

Sham.假手術(shù)組；LPS.膿毒癥肝損傷組；LPS+GW0742.膿毒癥肝損傷+激動(dòng)劑組；LPS+GSK0660.膿毒癥肝損傷+抑制劑組

討 論

本研究采用小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)觀察不同組別膿毒癥小鼠6、12、24h肝臟的損傷情況，并分別從血清學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)角度進(jìn)行分析，探討PPAR-β對(duì)小鼠膿毒癥肝損傷的作用。

血清學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,小鼠腹腔注射LPS后，從6h開始，ALT、AST和TBIL水平均顯著升高，12h達(dá)到最高水平，24h數(shù)值逐漸減低，表明LPS對(duì)小鼠產(chǎn)生了炎性反應(yīng)，發(fā)生了肝損傷，與既往研究結(jié)果一致[18～20]。且數(shù)值隨時(shí)間變化而變化，在6h開始升高，12h達(dá)到高峰，24h開始降低，表明膿毒癥肝損傷在12h最為嚴(yán)重。LPS+GW0742組ALT、AST和TBIL水平與LPS組比較，在6、12、24h均顯著降低，而LPS+GSK0660組與LPS組比較，在6、12、24h基本無(wú)變化，表明使用特異性配體激活PPAR-β表達(dá)后，可以減輕肝損傷，而使用特異性配體抑制PPAR-β表達(dá)后，不能減輕肝損傷，表明內(nèi)源性激動(dòng)劑增加 PPAR-β表達(dá)后，可以通過(guò)抑制環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，減少氧自由基的釋放，減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷，對(duì)小鼠膿毒癥肝損傷有一定的保護(hù)作用，與既往研究結(jié)果一致[15]。提示在膿毒癥治療過(guò)程中，前6h為治療的黃金時(shí)間，盡早使用有效的藥物治療，可以減輕膿毒癥的炎性反應(yīng)。LPS組炎性因子表達(dá)均高于Sham組；而LPS+GW0742組炎性因子表達(dá)低于LPS組；LPS+GSK0660組表達(dá)與LPS組無(wú)明顯差距，表明PPAR-β被特異性激動(dòng)劑激活后，可以抑制NF-κB活性，減輕TNF-α等炎性因子的表達(dá)，與既往研究一致[16]。

綜上所述，膿毒癥小鼠高表達(dá)TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB，PPAR-β可通過(guò)抑制環(huán)氧酶 (cyclooxygenase，COX)活性，減少線粒體氧自由基的釋放，并通過(guò)下調(diào)NF-κB分子的表達(dá)及炎性因子的產(chǎn)生，從而減輕小鼠膿毒癥肝損傷。而最新研究已證實(shí)，PPAR-β可以促進(jìn)β氧化, 降低甘油三酯和游離脂肪酸的循環(huán)水平,有加快脂肪酸的分解代謝、改善胰島素的敏感度及炎癥的抑制作用。本研究不足之處為僅對(duì)肝損傷最為嚴(yán)重的12h進(jìn)行蛋白含量測(cè)定表達(dá)，下一步將對(duì)其他時(shí)間段進(jìn)行測(cè)量，并將結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及從降低脂肪酸水平等開展多方面機(jī)制研究，有望為膿毒癥的治療提供新的靶點(diǎn)。