鄭光磊 沈曉強(qiáng) 謝亞明 顧曉民

骨折不愈合(nonunion)是指骨折經(jīng)過治療，超過一般愈合時(shí)間，且經(jīng)再延長治療時(shí)間，仍達(dá)不到骨性愈合，影像學(xué)上表現(xiàn)為骨折端骨痂少或無，兩斷端萎縮、分離，髓腔封閉。美國食品藥品管理局(FDA)將骨折不愈合定義為骨折治療后9個(gè)月未愈合，或在影像學(xué)上表現(xiàn)為至少3個(gè)月內(nèi)無進(jìn)展性愈合跡象[1～3]。臨床上骨不愈合的發(fā)生多與高能量損傷、創(chuàng)傷后感染、骨缺損、不恰當(dāng)?shù)闹委煹纫蛩赜嘘P(guān)[4～6]。據(jù)報(bào)道，骨折不愈合發(fā)生率約為5%～10%[7]。既往的治療方法包括低強(qiáng)度脈沖式超聲波、鋼板內(nèi)固定聯(lián)合骨移植、髓內(nèi)釘動(dòng)力化處理等，均有各自的不足或缺陷。例如超聲波等非手術(shù)治療方法療效欠佳，目前僅作為輔助治療手段；更換內(nèi)植物及骨移植等方法費(fèi)用高、創(chuàng)傷大，相應(yīng)并發(fā)癥多，部分患者難以接受。而相比之下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療具有來源充足、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，且近年來已有研究者通過局部注射的方法將BMSCs應(yīng)用于骨折的治療并取得不錯(cuò)的療效。本研究在保留干細(xì)胞療法優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，將介入治療準(zhǔn)確、安全、高效、并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)與干細(xì)胞治療相結(jié)合，通過實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、影像學(xué)改變及組織學(xué)證據(jù)來觀察經(jīng)股動(dòng)脈注入BMSCs治療骨折不愈合的療效，以探索具有更廣、更優(yōu)臨床應(yīng)用前景的治療骨折不愈合的新療法。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與儀器:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)健康雄性新西蘭兔27只，體質(zhì)量2.5±0.5kg，由余姚市泗門鎮(zhèn)建飛實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖場提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2012-0050。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(受理編號(hào)：2018068)。(2)主要材料：第2代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(中國Cyagen公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Cellmax公司)，PBS(美國HyClone公司)，胰酶(美國HyClone公司)，無血清細(xì)胞凍存液(日本W(wǎng)ako公司)，青鏈霉素(美國HyClone公司)，慢病毒(Lentivirus)，嘌呤霉素(puromycin)，20%烏拉坦，注射用青霉素，10%EDTA，10%中性甲醛溶液，蘇木精染液、伊紅染液，二甲苯等。細(xì)胞培養(yǎng)皿，離心管，刻度吸管，凍存管，細(xì)胞刮刀(美國Corning公司)等。(3)主要儀器：-80℃超低溫冰箱，恒溫水浴箱(英國BioCote公司)，超凈工作臺(tái)，低溫冰箱，低速離心機(jī)(中國中佳公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)，二氧化碳孵箱(美國Thermo公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，石蠟包埋機(jī)及切片機(jī)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)等。

2.熒光骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：將凍存的第2代兔BMSCs復(fù)蘇于6cm×6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80%～90%時(shí)，細(xì)胞換液處理后加入慢病毒(200μl，攜帶EGFP基因)及Polybrene(5μg/ml)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8h后換液，再加入嘌呤霉素(0.5μl/ml)篩選3～5天，最終獲得符合條件的帶綠色熒光(EGFP)的兔BMSCs。

3.骨折不愈合動(dòng)物模型的建立：麻醉成功后，取實(shí)驗(yàn)兔左后肢術(shù)區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，在股骨中段造成1cm的骨質(zhì)缺損并予以克氏針行髓內(nèi)固定后縫合。術(shù)畢抗生素使用3天后常規(guī)飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)所用抗生素為頭孢呋辛鈉，劑量為0.14g/kg)。術(shù)后定期行患肢X線檢查觀察骨折斷端骨折愈合情況，術(shù)后8周骨折線可見，斷端分離，兩端未見明顯骨痂形成，骨折不愈合動(dòng)物模型建立成功(預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)行骨折斷端病理組織切片觀察見兩斷端無新生骨組織連接)。

4.分組及動(dòng)脈置管:將所有建模成功的實(shí)驗(yàn)兔編號(hào)后隨機(jī)分為3組,即A組(經(jīng)股動(dòng)脈注入BMSCs,血管介入組)、B組(局部注射BMSCs，局部注射組)、C組(經(jīng)股動(dòng)脈注入PBS，PBS對照組)，每組9只。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行骨折同側(cè)股動(dòng)脈置管，并將留置針固定于皮下。

5.干預(yù)方式：留置針置入成功后次日起，根據(jù)不同組別分別給予相應(yīng)干預(yù)。A組予經(jīng)股動(dòng)脈內(nèi)注入BMSCs(1×105/10ml,每天1次)，B組予經(jīng)皮骨折端局部注射BMSCs(1×105/10ml,每天1次)，C組予經(jīng)股動(dòng)脈注入PBS液(10ml，每天1次)。所有實(shí)驗(yàn)兔連續(xù)干預(yù)3天后拔除動(dòng)脈留置針，常規(guī)飼養(yǎng)。

6.骨折端干細(xì)胞觀察:干預(yù)結(jié)束后第2天，每組隨機(jī)抽取3只實(shí)驗(yàn)兔，于麻醉狀態(tài)下取其患肢股骨，用完全培養(yǎng)基沖洗吹打髓腔得到?jīng)_洗液。將沖洗液進(jìn)行離心、分離、重懸、接種得到兔BMSCs懸液，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分別在400倍的倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察并拍攝相同視野中各組細(xì)胞的生長分布情況，應(yīng)用MATLAB圖像處理軟件進(jìn)行分析處理，以熒光細(xì)胞面積(△S)占圖像總面積(S)的百分比(P)來衡量各組骨折端熒光干細(xì)胞的聚集情況，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P(%)= △S/S。

7.骨骼代謝水平檢測:所有實(shí)驗(yàn)兔于干預(yù)前3天連續(xù)檢測骨代謝中ALP、OCN水平，通過比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異后各組取3天的平均值作為術(shù)前指標(biāo)，并于干預(yù)后3、5、7和15天測定外循環(huán)中ALP、OCN含量變化，可反映骨折愈合早期動(dòng)物體內(nèi)骨骼代謝水平的變化。

8.影像學(xué)檢查:所有實(shí)驗(yàn)兔均于干預(yù)結(jié)束后2、4、8周接受患肢X線檢查，根據(jù)骨折斷端骨皮質(zhì)連接情況、骨痂生成量及連續(xù)性對骨折愈合情況進(jìn)行評(píng)估，并做影像學(xué)評(píng)分,詳見表1[8]。

表1 X線骨痂評(píng)分表

9.病理組織學(xué)觀察:干預(yù)后4、8周，每組隨機(jī)選取3只實(shí)驗(yàn)兔，在影像學(xué)檢查之后以麻醉藥物過量方式處死，嚴(yán)格無菌條件下取出左側(cè)股骨，以斷端為中點(diǎn)截取骨折兩端各約0.5cm骨質(zhì)，脫鈣處理后石蠟包埋，制作3μm縱向骨組織切片，HE染色觀察骨折端新生骨組織生長情況。

結(jié) 果

1.顯微鏡下觀察骨折端熒光干細(xì)胞聚集情況:干預(yù)結(jié)束后第2天各組鏡下熒光干細(xì)胞的生長分布情況見表2、圖1。3組干細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下分布均勻，呈長梭型生長，細(xì)胞狀態(tài)良好(圖1A、圖1C、圖1E)。從熒光顯微鏡的鏡下圖像可以看到，A組(血管介入組)中絕大部分干細(xì)胞帶有綠色熒光(圖1B)，B組(局部注射組)中部分細(xì)胞帶有綠色熒光，但B組細(xì)胞的綠色熒光面積百分比含量明顯小于A組(圖1D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C組(PBS對照組)細(xì)胞皿中干細(xì)胞不帶綠色熒光(圖1F)。

表2 熒光細(xì)胞面積百分比

A.血管介入組;B.局部注射組;C.PBS對照組;與B組比較，*P<0.01

圖1 3組熒光干細(xì)胞生長分布情況(×400)

2.血清中ALP、OCN含量測定：各組外周血中ALP、OCN治療前后的含量變化見表3、表4、圖2。A組(血管介入組)和B組(局部注射組)在干預(yù)后血清中ALP和OCN的整體水平較干預(yù)前明顯升高，且在1周內(nèi)始終高于術(shù)前水平，15天后略有回落；C組(PBS對照組)血清中ALP和OCN水平在干預(yù)前后沒有明顯變化。術(shù)后5天，A組和B組血清中ALP水平較治療前均明顯升高(P<0.01)，且與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；術(shù)后7天，A組和B組血清中OCN水平較治療前也明顯升高(P<0.01)，同時(shí)與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組動(dòng)物術(shù)前與術(shù)后外周血中ALP水平比較

A.血管介入組;B.局部注射組;C.PBS對照組;與C組比較，*P<0.01；與組內(nèi)術(shù)前比較，#P<0.01

表4 各組動(dòng)物術(shù)前與術(shù)后外周血中OCN水平比較

A.血管介入組;B.局部注射組;C.PBS對照組;與C組比較，*P<0.01；與組內(nèi)術(shù)前比較，#P<0.01

圖2 干預(yù)前后各組動(dòng)物外周血中ALP、OCN水平組內(nèi)和組間的比較*P<0.01

3.影像學(xué)改變比較:A組(血管介入組)和B組(局部注射組)動(dòng)物在接受BMSCs治療后骨折端有骨痂生長，并在術(shù)后8周形成連續(xù)骨痂，骨折基本愈合；而C組(PBS對照組)動(dòng)物的骨折端在整個(gè)治療過程中始終無骨痂形成(表5)。A組骨折端骨痂評(píng)分在術(shù)后4周時(shí)高于B組(P<0.05)，但在術(shù)后8周時(shí)兩組骨痂情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。術(shù)后2周A、B、C 3組骨折線明顯，骨折斷端分離，均未見明顯骨痂生長(圖4A、圖4D、圖4G)。術(shù)后4周，A組骨折端有云霧樣骨痂形成，包繞在骨折端周圍(圖4B)；B組骨折端骨痂顯示不清，骨折線模糊(圖4E)；C組骨折斷端分離(圖4H)。術(shù)后8周，A、B兩組骨折端兩側(cè)被大量連續(xù)的骨痂包繞，骨折愈合良好，而C組骨折仍未愈合(圖4C、圖4F、圖4I)。

表5 A、B兩組干預(yù)后骨痂評(píng)分比較

A.血管介入組;B.局部注射組;C.PBS對照組;與A組比較，*P<0.05

圖3 干預(yù)后A組(血管介入組)和B組(局部注射組)骨痂評(píng)分組間比較*P<0.05

4.組織病理學(xué)觀察：術(shù)后4周，A組(血管介入組)骨折端有大量呈網(wǎng)狀分布的軟骨細(xì)胞，局部有連續(xù)性新生骨組織形成，間質(zhì)炎性反應(yīng)輕(圖5A)；B組(局部注射組)骨折端軟骨細(xì)胞呈島狀分布，組織間隙少量炎性細(xì)胞浸潤(圖5C)；C組(PBS對照組)骨折端無骨組織，斷端分離明顯(圖5E)。術(shù)后8周，A組骨折端新生骨組織成片出現(xiàn)(圖5B)；B組大部分骨組織已連接成片，部分?jǐn)喽四?nèi)軟骨正向成熟骨組織轉(zhuǎn)變(圖5D)；C組骨折端骨組織不連續(xù)(圖5F)。

圖4 3組影像學(xué)表現(xiàn)變化

圖5 3組病理組織學(xué)表現(xiàn)變化(HE)

討 論

骨不愈合作為骨折晚期并發(fā)癥之一，常因骨折部位的持續(xù)活動(dòng)而出現(xiàn)疼痛，極大降低了患者的生活質(zhì)量。因此，如何防治骨不愈合一直是骨科及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)工作者多年來不斷深入探究的重要課題之一[9]。在現(xiàn)有的治療方法中，自體骨移植被認(rèn)為是治療骨折不愈合的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其臨床治愈率可達(dá)86%～94%[10]。自體骨移植具有良好的骨生成、骨誘導(dǎo)及成骨能力，而且價(jià)格低廉、無排斥反應(yīng)[11～13]。但該手術(shù)方式因自體骨量有限，術(shù)后供區(qū)疼痛、感染等缺點(diǎn)而無法被部分患者接受。雖然人工骨移植材料在一定程度上彌補(bǔ)了自體植骨的缺陷，但是人工骨生物活性不足、成骨誘導(dǎo)能力弱、感染風(fēng)險(xiǎn)高，實(shí)際治愈率遠(yuǎn)不及自體骨[14]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為體內(nèi)干細(xì)胞的主要來源，在體內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控和誘導(dǎo)下可定向分化為成骨細(xì)胞，參與骨折修復(fù)過程[15～18]。目前也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明BMSCs在骨肌系統(tǒng)修復(fù)與再生方面具有良好的療效[19,20]。但是，干細(xì)胞目前的一些療法都有其明顯的弊端，比如雖然Homma等[21]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮注射自體骨髓移植是治療非感染性萎縮性骨不愈合安全有效的方法，但是局部注射無法使干細(xì)胞在骨折端很好地聚集。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(PRP)能有效地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力、成骨分化能力和增殖能力，但PRP和生物支架法操作難度大、費(fèi)用高，且多數(shù)生物支架的降解較快，影響干細(xì)胞成骨分化，因此，需要更具有臨床應(yīng)用價(jià)值的治療方法[22～25]。

本研究中筆者通過血管介入的方法將BMSCs注入股動(dòng)脈，采用熒光示蹤的方法觀察BMSCs在骨折端的聚集情況并評(píng)估其對骨折不愈合的療效。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到實(shí)驗(yàn)干預(yù)給予的帶有綠色熒光的BMSCs可在骨折端有一定程度的聚集，且A組(血管介入組)干細(xì)胞在骨折端的匯聚情況明顯優(yōu)于B組(局部注射組)，這說明與局部注射法比較，經(jīng)血管注入法能使干細(xì)胞更好的在骨折端歸巢。這可能是外周循環(huán)中諸如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)等趨化因子的作用所致。而局部注射的干細(xì)胞可能會(huì)滲漏到骨折周圍的軟組織中，使得最終到達(dá)骨折斷端的細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)少于注射量；同時(shí)，經(jīng)皮注射的干細(xì)胞只能作用到骨折端的某一點(diǎn)或者局部，無法使干細(xì)胞均勻分布于骨折兩端的整個(gè)截面。因此，筆者認(rèn)為經(jīng)動(dòng)脈注入干細(xì)胞的方法要優(yōu)于經(jīng)皮局部注射法。

ALP和OCN是反映成骨細(xì)胞活性的早期特異性指標(biāo)。ALP通過水解細(xì)胞外基質(zhì)中的磷酸酯，為成骨提供骨鹽，其水平高低可反映前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的程度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，A組和B組動(dòng)物術(shù)后外周血中ALP水平較術(shù)前明顯升高(P<0.01)，術(shù)后5天達(dá)最高峰，而C組動(dòng)物的ALP值無明顯變化。OCN作為成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，可以抑制羥磷灰石結(jié)晶形成、降低生長軟骨礦化速度并促進(jìn)骨組織礦物質(zhì)沉積，是反映骨轉(zhuǎn)換和骨形成的重要指標(biāo)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B兩組動(dòng)物外周血中OCN水平在術(shù)后第7天明顯升高且均高于C組(P<0.01)，而C組外周血中OCN含量無明顯變化。綜合各組ALP、OCN水平變化可以說明BMSCs可以加強(qiáng)骨折端成骨活動(dòng)，使骨折端成骨細(xì)胞數(shù)量增多，活性增強(qiáng)，骨代謝活躍。其原因可能是BMSCs在骨折端受各種細(xì)胞因子的作用定向增殖分化為成骨細(xì)胞，參與骨折愈合。

骨愈合分為Ⅰ期愈合與Ⅱ期愈合。Ⅰ期愈合屬于直接愈合，由新生的板層骨直接取代死骨，愈合過程中骨痂少或無。Ⅱ期愈合是間接愈合，是先形成軟骨痂，再逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣墙M織并塑性，在影像學(xué)上可見骨折端大量的骨痂形成。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)兔的骨愈合過程屬于Ⅱ期愈合。A、B、C 3組在術(shù)后2周的影像學(xué)表現(xiàn)上均無骨折愈合跡象(圖4)。而在術(shù)后4周時(shí)，A、B兩組骨折斷端見骨折線模糊，并有少量骨痂形成，C組骨折線仍明顯，由此可見BMSCs可以促進(jìn)骨折端骨痂形成；同時(shí)A組骨折端可見云霧樣骨痂，其骨痂的生長情況優(yōu)于B組，由此推斷經(jīng)動(dòng)脈注入干細(xì)胞法的生物效應(yīng)較局部注射法強(qiáng)。術(shù)后8周時(shí)，A、B兩組骨折端均被大量連續(xù)骨痂包繞，骨折基本愈合，而C組始終無骨折愈合跡象，證明BMSCs可以促進(jìn)骨折愈合。A、B兩組動(dòng)物在經(jīng)BMSCs治療后4周，骨折端出現(xiàn)軟骨細(xì)胞；8周后逐漸轉(zhuǎn)化為成熟的骨組織并連接骨折斷端，最終實(shí)現(xiàn)骨折愈合；而C組在組織學(xué)上始終表現(xiàn)為斷端分離，無連續(xù)的骨組織形成(圖5)。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出以下結(jié)論：①BMSCs在治療骨折不愈合的過程中提高骨骼代謝水平，加快骨痂生成，促進(jìn)骨折愈合；②與局部注射法比較，血管介入法能使BMSCs更好地在骨折端歸巢并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，從而促進(jìn)早期骨痂生成。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)血管介入法有一定的生物學(xué)優(yōu)勢，但仍存在以下問題和不足：①動(dòng)脈留置針容易堵塞，長期放置可能使血管局部血栓形成，甚至有發(fā)生血管閉塞的可能；②干細(xì)胞的歸巢程度未達(dá)到預(yù)期，下一步研究可考慮在骨折端周圍增加趨化因子濃度；③本研究尚未探知干細(xì)胞治療的最佳劑量，需進(jìn)一步研究探索;④因客觀條件制約，本研究中骨代謝指標(biāo)只涉及成骨活性，缺少相應(yīng)的破骨細(xì)胞活性指標(biāo)，需在今后的研究中進(jìn)行完善。