買(mǎi)買(mǎi)提·依斯熱依力 吾布力卡斯木·吾拉木 李義亮 艾克拜爾·艾力 阿孜古麗·阿力木江 曹正一 阿布拉江·米吉提 蔣 媛 趙新勝 克力木·阿不都熱依木

隨著社會(huì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，心理應(yīng)激在各種疾病中的作用變得越來(lái)越突出。據(jù)報(bào)道，心理應(yīng)激已成為75%～90%的疾病的共同危險(xiǎn)因素[1]。胃食管反流(gastroesophageal reflux disease, GERD)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的功能性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與心理因素之間的相關(guān)性已得到證實(shí)。焦慮和抑郁等心理因素增加罹患GERD的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致GERD癥狀的加重[2,3]。

食管黏膜防御功能主要由上皮屏障構(gòu)成，任何一種或多種防御機(jī)制的缺陷均可導(dǎo)致食管對(duì)胃內(nèi)容物(胃酸、膽汁等)清除能力降低，繼而引起食管上皮損傷，食管上皮細(xì)胞緊密連接(tight junction, TJ)蛋白的表達(dá)下降是其重要發(fā)生機(jī)制[4]。GERD患者食管上皮TJ蛋白表達(dá)異?？芍苯訉?dǎo)致食管上皮細(xì)胞間隙增寬(dilated intercellular space, DIS)，這一組織學(xué)變化也許能作為GERD食管形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的客觀指標(biāo)[5]。

食管上皮的通透性取決于TJ蛋白的完整性。在GERD動(dòng)物模型中，食管黏膜暴露于酸或酸化的胃蛋白酶環(huán)境會(huì)使TJ蛋白破壞，從而造成細(xì)胞旁通路對(duì)水、電解質(zhì)和低分子物質(zhì)的通透性增加，導(dǎo)致食管鱗狀上皮出現(xiàn)DIS[6]。這可能是部分難治性GERD患者使用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors, PPIs)治療后，癥狀仍持續(xù)存在的原因之一?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)在許多疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，也被認(rèn)為是GERD、Barrett食管的發(fā)病重要機(jī)制之一。因此，本研究通過(guò)建立小鼠慢性束縛應(yīng)激(Stress)模型，探討心理應(yīng)激誘導(dǎo)活性氧(ROS)介導(dǎo)的食管TJ蛋白表達(dá)及在DIS發(fā)生中所產(chǎn)生的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)雄昆明小鼠25只，8周齡，購(gòu)于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0001；飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動(dòng)物中心。25只小鼠進(jìn)行編號(hào)及體質(zhì)量測(cè)量，并排除體質(zhì)量變異較大的5只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機(jī)分為兩組(各10只)，即慢性束縛應(yīng)激(Stress)組和正常對(duì)照(Control)組。小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12h晝夜循環(huán)，光照均始于8：30時(shí)，止于20：30時(shí)。

2.Stress模型的建立:所有小鼠在相同環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。模型開(kāi)始建立后，所有束縛應(yīng)激均在每日上午10：30時(shí)～12：30時(shí)進(jìn)行。10只Stress組小鼠置于用50ml離心管所制的自制式束縛器中(離心管提前燙制出直徑約5mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁，管口塑料蓋做1個(gè)小孔以暴露小鼠尾巴)，每天限制活動(dòng)2h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，連續(xù)束縛14天。Control組小鼠自由飲水?dāng)z食，其余時(shí)間兩組小鼠處理相同。

3.取材與標(biāo)本處理:束縛應(yīng)激第14日下午17：00時(shí)開(kāi)始對(duì)所有小鼠禁食，于次日11：00時(shí)進(jìn)行取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口取3cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5ml EP管中。在距離胃食管交界處0.3cm處和1.5cm處剪斷取材，置于4%中性甲醛固定。食管標(biāo)本4%中性甲醛固定24h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚切片行HE染色。各組食管下段組織常規(guī)HE染色后，光學(xué)顯微鏡(油鏡)下并放大千倍不同部位上拍攝10張光鏡照片，使用Image J等圖像處理軟件數(shù)字化測(cè)量細(xì)胞間隙。

4.免疫組化染色:石蠟切片脫蠟水化后，10%過(guò)氧化氫甲醛阻斷過(guò)氧化物酶，檸檬酸法高壓修復(fù)抗原，山羊血清封閉1h，分別在不同切片滴加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, Nox-4)一抗(1∶100)，4℃過(guò)夜，滴加二抗，37℃孵育30min，DAB顯色。以PBS 液取代一抗作為陰性對(duì)照。每只小鼠胃組織標(biāo)本隨機(jī)取兩張切片，光鏡下觀察胃黏膜染色情況，在200倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行拍照，以明顯黃色/棕黃色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR:采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)Nox-4、Nrf-2、HO-1、閉合蛋白-1(Claudin-1)、閉合蛋白-4(Claudin-4)、咬合蛋白(Occludin)及胞質(zhì)緊密黏連蛋白-1(zonula occludens, ZO-1)mRNA的表達(dá)。取每只小鼠食管組織20mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，各指標(biāo)及β-肌動(dòng)蛋白(actin)引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量RT-PCR,反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為94℃ 3min,然后95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s，共40循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動(dòng)得出熒光曲線及CT 值,采用2—△△Ct計(jì)算出Stress組小鼠食管組織相對(duì)于Control組中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

6.蛋白質(zhì)印跡(WB)法:加入50mmol/L PIPA蛋白裂解液裂解組織細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。每孔50μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二佛乙烯(PVDF)膜上，封閉，洗膜后加一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜，然后用1×TBST洗膜3次×5min，再與二抗(1∶10000)室溫孵育1h，在用1×TBST洗膜3次×5min。β-actin作為內(nèi)參照。置于凝膠成像儀中照相并應(yīng)用Image J軟件對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf-2)及血紅素氧合酶-1(heme oxygenase, HO-1)及β-actin蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行定量分析處理，用Nrf-2與HO-1蛋白目的條帶與β-actin條帶的灰度值比值表示Nrf-2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(Nrf-2/β-actin、HO-1/β-actin)。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

7.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定:取血后不經(jīng)任何處理，4℃下靜置2h，之后以3500r/min的速度低溫離心5min，取上層血清，-80℃保存，用于后續(xù)測(cè)定。ELISA法檢測(cè)血清中Nox-4、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHDG)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及測(cè)量指標(biāo)濃度的計(jì)算嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié) 果

1.Stress對(duì)小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量的影響：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前Stress組小鼠體質(zhì)量為25.85±1.35g，Control組小鼠體質(zhì)量為24.62±1.43g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.36，P>0.05)；14天的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Stress組小鼠平均每日進(jìn)食量為12.85±1.42g，Control組為12.98±1.25g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.83，P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Stress組小鼠體質(zhì)量增加量為7.95±2.45g，Control組小鼠體質(zhì)量增加量為11.32±2.23g，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.78，P<0.01)。

表2 Stress對(duì)小鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量的影響

與Control組比較，*P<0.01

2.Stress對(duì)小鼠食管黏膜組織的影響:兩組小鼠食管上皮細(xì)胞鏡下測(cè)量的平均細(xì)胞間隙為Control組0.71±0.18μm、Stress組1.18±0.12μm，與Control組比較，Stress組小鼠上皮細(xì)胞間距明顯增寬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖1)。

圖1 兩組食管上皮細(xì)胞間隙測(cè)量與Control組比較，*P=0.000

3.氧化蛋白的表達(dá):Nox-4免疫染色陽(yáng)性著色細(xì)胞在Stress組小鼠組織中表達(dá)較Control組染色深且豐富，主要表達(dá)于固有層、黏膜及黏膜下層。Stress組小鼠食管黏膜中Nox-4 mRNA水平是Control組的2.36±0.34倍，而Stress組血清Nox-4的釋放濃度是Control組的2.25±0.27倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.56，P=0.000)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Stress組小鼠中8-OHdG(3.95±0.25 vs 1.65±0.38)和MDA(0.95±0.01 vs 2.48±0.20)的血清表達(dá)水平顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-23.45，P=0.000),詳見(jiàn)圖2。

圖2 兩組食管氧化蛋白Nox-4、8-OHdG及MDA表達(dá)情況A.食管組織Nox-4免疫組化染色(×200)情況；B.食管組織Nox-4 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；C.血清Nox-4濃度；D.血清8-OHdG濃度；E.血清MDA濃度。與Control組比較，*P=0.000

4.抗氧化蛋白的表達(dá):抗氧化蛋白的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Stress組Nrf-2、HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于Control組的1.82±0.35倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.25，P=0.000)；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)表示，Stress組小鼠食管組織中Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于Control組,詳見(jiàn)圖3。

5.TJ蛋白的表達(dá):食管上皮組織TJ蛋白重要指標(biāo)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Stress組TJ蛋白Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，分別是Control組的1.67±0.28、1.54±0.22、1.85±0.35、1.74±0.42倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.34、-14.78、-17.63、-12.27，P=0.000)，詳見(jiàn)圖4。

圖3 兩組食管氧化蛋白Nrf-2和HO-1表達(dá)情況A.食管組織Nrf-2 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；B.食管組織HO-1mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；C.Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá)量。與Control組比較，*P=0.000

圖4 兩組食管組織TJ蛋白的表達(dá)情況A.食管組織Claudin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；B.食管組織Claudin-4 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；C.食管組織Occludin mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)；D.食管組織ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。與Control組比較，*P=0.000

討 論

心理壓力(應(yīng)激)在GERD發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，約64%的GERD患者因受到精神壓力的影響可使其癥狀持續(xù)加重，這提示反流癥狀的加重與心理因素(抑郁、焦慮)密切有關(guān)[7，8]。GERD是一種多疾病綜合征而非單一的發(fā)病機(jī)制所致，反流癥狀會(huì)嚴(yán)重影響人的精神和心理狀態(tài)。應(yīng)激是機(jī)體在受到心理、環(huán)境及生理性(內(nèi)環(huán)境)應(yīng)激源刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)。對(duì)GERD患者的研究中可發(fā)現(xiàn)焦慮、抑郁等心理應(yīng)激與食管高敏感度有著較密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，伴有焦慮的人群患GERD的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的3.2倍，伴抑郁者是其1.7倍，而同時(shí)合并焦慮及抑郁者為2.8倍[9]。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，不同亞型GERD(NERD、RE)患者中酸反流可激活致敏指標(biāo)(TRPV-1、PAR-2)受體，進(jìn)而引起食管高敏感度產(chǎn)生[10]。食管黏膜的損傷、酸反流、食管動(dòng)力學(xué)的改變等都不能全面地解釋GERD胃灼痛、胸痛的癥狀的發(fā)生。因此，那些有GERD癥狀而無(wú)酸反流的患者癥狀產(chǎn)生機(jī)制尚未清楚，心理壓力與食管超微結(jié)構(gòu)改變(如DIS)機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

心理壓力增高是誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)發(fā)生的重要機(jī)制，而ROS也在GERD、Barrett食管和腺癌等諸多疾病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[11,12]。機(jī)體在正常的生理情況下，有極少量的自由基(redox)產(chǎn)生，而體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)有能力予以清除，redox便處于穩(wěn)態(tài)平衡(redox homeostasis, RH)。但ROS生成過(guò)多或抗氧化防御系統(tǒng)的能力降低，redox的穩(wěn)態(tài)失去平衡，此時(shí)的穩(wěn)態(tài)失衡可能是急性、短暫性或慢性的，在這種情況下，ROS就能引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變形，DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，組織氧化損傷(oxidative stress, OS)[13]。Song等[12]研究表明，GERD發(fā)病機(jī)制由ROS介導(dǎo)的，他們通過(guò)在反流大鼠模型中使用青蒿發(fā)現(xiàn)食管黏膜ROS的產(chǎn)生被抑制，黏膜炎癥發(fā)生也得到了有效的控制。ROS參與RE食管黏膜的損傷過(guò)程，激活細(xì)胞內(nèi)NF-kappa B(NF-κB)等經(jīng)典信號(hào)通路并促進(jìn)炎性因子如白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的轉(zhuǎn)錄，使炎性效應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大，食管黏膜的損傷不斷加重。NADPH為細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的酶復(fù)合體，是主要的ROS來(lái)源，其中Nox-4與ROS關(guān)系較密切的氧化酶。8-OHdG的形成是反應(yīng)組織DNA氧化損傷和致癌的重要生物學(xué)標(biāo)志物。ROS的代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)和不飽和醛引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)失去功能，還具有致突變，致癌活性等作用。這些重要ROS標(biāo)志物在食管組織中表達(dá)及上皮細(xì)胞間隙增寬(DIS)發(fā)生中的意義仍需進(jìn)一步的研究。

Nrf-2以及下游基因HO-1是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御機(jī)制中的重要蛋白體系，該體系通過(guò)上調(diào)抗氧化酶反應(yīng)性元件攜帶因子(如內(nèi)源性抗氧化酶)的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制細(xì)胞的命運(yùn)[14]。Nrf2/HO-1通路調(diào)控組織或細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性解毒酶及抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá)。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf-2-/-基因敲除小鼠出現(xiàn)胃酸反流并導(dǎo)致食管及胃底角化, Nrf2缺乏進(jìn)一步減少了被回流抑制的單層細(xì)胞的跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)，從而引起食管DIS、黏膜損傷并使得食管上皮屏障功能異常。因此，機(jī)體受到心理應(yīng)激作用導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過(guò)多，超出機(jī)體氧化物的清除能力，使得氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，而引起氧化損傷的加重。本研究結(jié)果顯示，Stress組小鼠食管組織中氧化蛋白重要指標(biāo)(Nox-4、8-OHdG、MDA)與抗氧化蛋白(Nrf-2、HO-1)的免疫組化、血液中的釋放濃度、mRNA以及蛋白表達(dá)量與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明了心理應(yīng)激所誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。更重要的是，TJ蛋白指標(biāo)(Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1)在兩組中mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，筆者認(rèn)為氧化/抗氧化防御系統(tǒng)的平衡在維持食管黏膜穩(wěn)態(tài)及屏障中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，以DIS為代表的食管上皮屏障破壞，可使迷走神經(jīng)末梢暴露，引起其對(duì)各種刺激的反應(yīng)敏感化，甚至使分布于黏膜上層內(nèi)的神經(jīng)突起產(chǎn)生興奮，從而導(dǎo)致軸突末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)，直接引起食管感覺(jué)異常及疼痛反應(yīng)。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為心理壓力使食管氧化/抗氧化防御系統(tǒng)受損，進(jìn)而出現(xiàn)食管上皮存在的TJ蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常，可能是GERD發(fā)病機(jī)制之一。然而，氧化應(yīng)激參與食管DIS以及高敏感度的產(chǎn)生機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。