羅 荔 張 潔 張 麗 李曉嵐

臨床上缺血性腦損傷(cerebral ischemia injury)較常見(jiàn)，包括動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)的局灶性腦缺血、心跳驟停引發(fā)的全腦缺血等，腦卒中具有高發(fā)生率和高復(fù)發(fā)率，已成為世界第2常見(jiàn)死亡原因和主要致殘?jiān)騕1]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是一種非常重要的活性因子，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注動(dòng)物模型中，內(nèi)源性NGF mRNA表達(dá)會(huì)顯著增加，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，減輕腦缺血再灌注損傷[2]。在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活動(dòng)中，PI3K/Akt信號(hào)通路可以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是一條十分重要的細(xì)胞通路[3]。PI3K/Akt信號(hào)通路中蛋白激酶B(Akt)磷酸化后處于活化狀態(tài)，可以激活許多細(xì)胞保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制[4]。本研究基于腦缺血再灌注大鼠模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ后檢測(cè)NGF、Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax等蛋白及mRNA水平改變，探討轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，為腦缺血再灌注的治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組： 12周齡雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250～300g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：XJMU201700314。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房，每日光照約12h，自由飲食和飲水。為避免實(shí)驗(yàn)環(huán)境的改變對(duì)大鼠的影響，所有大鼠飼養(yǎng)2周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。72只SD大鼠隨機(jī)方法分為4組(n=18)，即假手術(shù)(sham)組、腦缺血再灌注(I/R)模型組、hNGFβ(I/R模型組+AAV6-hNGFβ-EGFP)組和陰性對(duì)照(I/R模型組+AAV6-EGFP)組，腦缺血再灌注模型成模后，模型組大鼠經(jīng)股靜脈注射0.3ml 0.9%氯化鈉注射液，hNGFβ組大鼠股靜脈單次注射0.3ml攜帶hNGFβ-EGFP基因的腺相關(guān)病毒(2×1010TU/ml)，陰性對(duì)照組大鼠股靜脈單次注射0.3ml攜帶EGFP(綠色熒光蛋白)基因的腺相關(guān)病毒(2×1010TU/ml)，各組注射1周后取材進(jìn)行腦組織熒光顯色。

2.材料： hNGFβ過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒AAV6-hNGFβ(中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，水合氯醛、多聚甲醛(中國(guó)成都科龍化工試劑廠)，Akt、p-Akt、NGF、Bcl-2和Bax抗體(美國(guó)CST公司)，TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶和熒光定量PCR試劑(中國(guó)上海生工生物工程有限公司)。

3.腦缺血再灌注模型的建立： 參照Longa法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型[5]。大鼠用10%水合氯醛麻醉后，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將制備好的線栓插入頸總動(dòng)脈，推進(jìn)約18～20mm，遇到阻力即可停止，阻斷2h后，緩慢撥出線栓，扎緊動(dòng)脈殘端，逐層縫合組織和皮膚，缺血再灌注損傷模型制備成功。假手術(shù)組除不插線栓外，其余步驟同上。術(shù)后按照改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neuro-logical severity scores，mNSS)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、感覺(jué)實(shí)驗(yàn)(視覺(jué)、觸覺(jué)和本體感覺(jué)等)、橫桿平衡實(shí)驗(yàn)和反射檢查，正常為0分，最高分為18分，分值越高神經(jīng)系統(tǒng)損傷越嚴(yán)重。

4.腦梗死面積測(cè)定： 分別在1、2、4周對(duì)各組大鼠進(jìn)行腦梗死面積的測(cè)定，每組6只，經(jīng)水合氯醛麻醉后，迅速開(kāi)胸進(jìn)行心臟灌流，灌流后快速斷頭取腦，洗凈后將腦組織在-20℃冰箱里冷凍20min，以2mm間距冠狀切成5～6片，用2%的TTC磷酸鹽緩沖液37℃避光染色30min，然后進(jìn)行4%多聚甲醛固定24h，采用醫(yī)用計(jì)算機(jī)彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死體積。

5.免疫組化和TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè)： 用免疫組化方法檢測(cè)NGF、Bcl-2、Bax和p-Akt的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)二甲苯，乙醇脫蠟至水，水洗后分別滴加相應(yīng)一抗，4℃靜置過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育30min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、樹(shù)脂封片，鏡下觀察，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。使用TUNEL 凋亡試劑盒進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)中鏈霉抗生物素蛋白(SABC)步驟染色，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，至水，蛋白酶K消化，TdT酶和DIG-dUTP混合液孵育2h，生物素偶聯(lián)抗地高辛抗體孵育2h，SABC孵育2h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞。

6.Western blot法檢測(cè)： 收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織，勻漿處理后抽提總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗后4℃孵育過(guò)夜，然后加入二抗室溫孵育1h后顯色曝光。采用圖像分析軟件Image J分析目的條帶，分別計(jì)算目的條帶與內(nèi)參的灰度值，用兩者比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

7.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)： 收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織，總RNA 的提取及熒光定量PCR參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

結(jié) 果

1.轉(zhuǎn)染效率觀察及腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分比較： 大鼠腦缺血/再灌注術(shù)造模成功，治療組和陰性對(duì)照組分別注射AAV6-hNGFβ-EGFP和AAV6-EGFP 1周后，熒光顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞中開(kāi)始有綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率較高，其余各組則無(wú)熒光(圖1)。治療組開(kāi)始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后1、2和4周，神經(jīng)功能評(píng)分同模型組及陰性對(duì)照組(模型組+AAV6-EGFP)比較，均出現(xiàn)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 大鼠腦組織神經(jīng)元綠色熒光表達(dá)(×200)A.陰性對(duì)照組; B.hNGFβ組

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與陰性對(duì)照組比較,△P<0.01

2.各組大鼠腦梗死體積比較：圖2的TTC染色結(jié)果顯示腦缺血再灌注損傷4周后腦梗死情況，除假手術(shù)組外其余各組均可見(jiàn)白色梗死部分。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦梗死體積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組及陰性對(duì)照組比較，hNGFβ組腦梗死體積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與陰性對(duì)照組比較，腦梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色A.假手術(shù)組; B.模型組; C.陰性對(duì)照組; D.hNGFβ組

圖3 各組大鼠腦梗死體積比較與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與陰性對(duì)照組比較,△P<0.01

3.免疫組化檢測(cè)NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax表達(dá)變化： 假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)NGF表達(dá)較多，p-Akt表達(dá)較少；造模成功后4周，與假手術(shù)組比較，模型組和陰性對(duì)照組皮質(zhì)區(qū)NGF表達(dá)減少，p-Akt表達(dá)增加；hNGFβ組轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，與模型組和陰性對(duì)照組比較，大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)NGF表達(dá)顯著升高，p-Akt表達(dá)也明顯增加(圖3)，Akt的磷酸化水平增強(qiáng)。另一方面，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)；hNGFβ組轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，與模型組和陰性對(duì)照組比較， Bcl-2表達(dá)顯著增加，Bax表達(dá)明顯減少。

圖4 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax免疫組化染色(×200)A.假手術(shù)組; B.模型組; C.陰性對(duì)照組; D.hNGFβ組

4.TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè)： 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦組織內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色顆粒，不規(guī)則形態(tài)的凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯增加；與模型組及陰性對(duì)照組比較，hNGFβ組神經(jīng)元細(xì)胞核染色變淺，凋亡細(xì)胞明顯減少。模型組與陰性對(duì)照組比較，凋亡神經(jīng)元數(shù)量接近(圖5)。

5.轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Akt磷酸化水平的影響： 收集各組大鼠腦組織，采用qPCR法和Western blot法檢測(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)不同病程(1、2、4周)NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，模型組和陰性對(duì)照組大鼠腦組織NGF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，Akt的mRNA表達(dá)水平顯著升高，p-Akt蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)明顯升高(P<0.01，圖6)。hNGFβ組轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP后，與模型組和陰性對(duì)照組比較，大鼠腦組織NGF的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，Akt的mRNA表達(dá)顯著升高，p-Akt表達(dá)也明顯增加，Akt的磷酸化水平顯著提升(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

圖5 TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞(×400)A.假手術(shù)組; B.模型組; C.陰性對(duì)照組; D.hNGFβ組

6.轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2和Bax表達(dá)影響： 收集各組大鼠腦組織，采用qPCR和Western blot法檢測(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)不同病程(1、2、4周)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。Bcl-2和Bax的qPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，模型組和陰性對(duì)照組中，Bcl-2和Bax的mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，hNGFβ組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)顯著升高(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)。

圖6 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表達(dá)變化A.NGF mRNA變化; B.NGF蛋白變化; C.Akt mRNA變化; D.p-Akt蛋白變化; 與假手術(shù)組比較, *P<0.01，**P=0.000;與模型組比較,#P<0.05，##P<0.01;與陰性對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖7 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)變化A.Bcl-2 mRNA變化; B.Bcl-2蛋白變化; C.Bax mRNA變化; D.Bax蛋白變化; 與假手術(shù)組比較, *P<0.01，**P=0.000；與模型組比較，#P<0.01;與陰性對(duì)照組比較，△P<0.01

討 論

大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型不需開(kāi)顱，對(duì)腦損傷較小，腦病變范圍與人體相近，部位恒定，梗死率高，是最常用的局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚5]。模型制備完成后，可通過(guò)改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究在腦缺血再灌注損傷大鼠體內(nèi)注射AAV6-hNGFβ-EGFP，進(jìn)行基因治療，使合成產(chǎn)物 hNGFβ得到高表達(dá)，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，治療組開(kāi)始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后，神經(jīng)功能評(píng)分同模型組與陰性對(duì)照組比較，均出現(xiàn)明顯降低。此外，大鼠的腦梗死體積計(jì)算結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP可以減少大鼠腦缺血再灌注損傷后的腦梗死體積。目前以改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的基因治療已得到廣泛應(yīng)用，席聰?shù)萚6]在I/R大鼠中注射rAAV-PR39-ADM過(guò)表達(dá)抗菌肽(PR39)和腎上腺髓質(zhì)素(ADM)后，可改善大鼠腦缺血再灌注后局部供血，促進(jìn)血管再生，保護(hù)神經(jīng)元，減輕腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷機(jī)制較復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基生成及高能磷酸化合物缺乏等[7～9]。在腦缺血再灌注程中，能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的因子減少，損害神經(jīng)細(xì)胞的因子增多(如氧自由基、炎性和凋亡因子等)，從而嚴(yán)重影響腦缺血性腦卒中患者的愈后，而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞并減少其凋亡，可以防止腦卒中引起的神經(jīng)功能障礙[10～12]。作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族(NTFs)中一種非常重要的活性因子，NGF在腦內(nèi)主要來(lái)源于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。腦缺血性損傷發(fā)生后，NGF不僅可以保護(hù)和減少神經(jīng)元損傷，還可以促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，提高神經(jīng)元存活率。腦缺血損傷發(fā)生早期，NGF會(huì)出現(xiàn)短時(shí)反應(yīng)性表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，但表達(dá)水平和時(shí)間有限，難以發(fā)揮全面持久的神經(jīng)元保護(hù)作用。

對(duì)于腦缺血后神經(jīng)損傷的保護(hù)而言，能持續(xù)增強(qiáng)NGF表達(dá)的治療方法，具有十分重要的意義。在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活動(dòng)中，PI3K/Akt信號(hào)通路可以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，該通路由許多靶點(diǎn)組成，其中蛋白激酶B(Akt)是最關(guān)鍵的一個(gè)，因?yàn)锳kt磷酸化后處于活化狀態(tài)，通過(guò)激活可作用于下游的B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)家族等靶點(diǎn)，可降低下游Bax蛋白的表達(dá)，抑制凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，NGF表達(dá)顯著下降，PI3K/Akt通路受到抑制，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和陰性對(duì)照組比較，hNGFβ組NGF表達(dá)顯著升高，PI3K/Akt通路得到激活，Bcl-2蛋白表達(dá)也顯著升高，Bax蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ-EGFP可提高NGF表達(dá)，激活大鼠PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白增加，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

在腦缺血再灌注動(dòng)物模型中，提高NGF的表達(dá)，可激活PI3K/Akt通路的多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)控下游相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。Saito等[14]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷后，由于PI3K與NGF受到抑制，磷酸化PRAS(pPRAS)的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，而加入NGF可以提高小鼠中pPRAS的表達(dá)，從而增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用。遠(yuǎn)端缺血后處理可以通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，激活PI3K/Akt途徑而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，減輕全腦缺血再灌注損傷[15]。此外，NGF還可通過(guò)激活PI3K/Akt途徑，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷進(jìn)行保護(hù)[16]。另一方面，NGF還可通過(guò)多種途徑保護(hù)神經(jīng)元損傷，如抵消興奮性氨基酸毒性、調(diào)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平和促進(jìn)自由基的清除等。Rami等[17]研究發(fā)現(xiàn)，β2腎上腺素受體激動(dòng)劑克倫特羅具有神經(jīng)保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與上調(diào)NGF表達(dá)有關(guān)，NGF上調(diào)可增強(qiáng)鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中早期阻斷TRPV2表達(dá)后，可以通過(guò)MAPK/JNK途徑誘導(dǎo)NGF分泌，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。NGF的神經(jīng)元保護(hù)作用還與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的激活有關(guān)，Shashoua等[19]設(shè)計(jì)了一種NGF的模擬短肽，可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1來(lái)進(jìn)行腦卒中的治療。

綜上所述，本研究基于腦缺血再灌注大鼠模型，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)、梗死體積、免疫組化和分子生物學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AAV6-hNGFβ可增強(qiáng)大鼠腦組織NGF表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白合成，抑制凋亡，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，為腦卒中的臨床治療提供依據(jù)。