王文超 鐘 曉 宋紫光 宋 湘

心力衰竭(簡稱心衰)是指由各種原因引起的心臟結構或功能改變，導致心室充盈和(或)射血功能受損的一組臨床綜合征[1]。心肌纖維化是由多種原因導致的正常心肌組織中細胞外基質沉積，膠原排列紊亂和成分比例失調為特點的疾病。心肌纖維化與多種心血管疾病密切相關，研究表明心力衰竭是心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的最終結果[2]。PKC為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，屬于AGC激酶[3]。PKC的結構由NH2-末端、三磷酸腺苷和底物COOH-末端組成[4]。 PKC各亞型廣泛分布于心肌細胞中,大量實驗表明PKC在調控心肌細胞增殖、心肌肥厚、心肌保護和信號轉導途徑等過程中起著重要作用[5]。PKC在多種生理活動中都具有調節(jié)作用。當發(fā)生心力衰竭時，PKC表達明顯升高[6]。Gal-3是由巨噬細胞激活分泌的一種蛋白，由單一基因LGALS3編碼，位于14號染色體，它由一個非典型N端和一個C端碳水化合物識別域組成[7]。Gal-3在心肌巨噬細胞、肥大細胞浸潤的過程發(fā)揮重要作用，能夠促進心肌纖維化及心臟膠原蛋白沉積，促使心肌肥厚、心肌順應性降低，最終導致心力衰竭的發(fā)生[8]。近年來研究表明，Gal-3是加重心力衰竭的一個重要因素，它參與心力衰竭的多種病理生理過程[9]，但Gal-3是否參與PKC介導的心力衰竭目前報道甚少，本研究擬通過質粒構建、細胞轉染和藥物刺激來研究PKC和Gal-3是如何對心肌細胞膠原蛋白產生影響。

材料與方法

1.質粒構建:采用PCR擴增技術在大鼠腎臟cDNA中擴增大小789bp的Gal-3翻譯區(qū)序列，并連接到p3xFLAG-CMV-10載體中。過程為Gal-3翻譯區(qū)基因序列合成含HindⅢ和XbaⅠ位點的Gal-3上游及下游引物，Gal-3基因設計引物(Accessory number NM_031832),包含Hind Ⅲ位點的上游引物：5′-CAAGCTTATGGCAGACGGCTTCTCACTTAATG-3′；包含XbaⅠ位點的下游引物：5′-CTCTAGACTTAGATCATGGCGTGGGAAGCGCT-3′以pTA-Gal-3為模板PCR擴增Gal-3基因，經HindⅢ和XbaⅠ酶切后連接到p3xFLAG-CMV-10載體上。通過核苷酸序列分析鑒定構建的質粒。pcDNA3-PKC-α的構建如之前構建進行[10]。

2.心肌細胞培養(yǎng):選擇小鼠HL-1心肌細胞，該細胞株由美國路易斯安那州立大學William.Claycomb教授惠贈。將該細胞培養(yǎng)在含有4mmol/L L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.1mmol/L去甲腎上腺素和1%青霉素的Claycomb培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)瓶和接種板涂上纖維連接蛋白，每36h更換培養(yǎng)基，根據實驗需要對其進行細胞轉染和藥物刺激。

3.細胞轉染和藥物刺激:將HL-1心肌細胞轉移至6孔板，使心肌細胞生長至90%融合，選擇Lipofectamine 2000按說明書方法轉染質粒，48h后收集蛋白進行Western blot法檢測。 需要添加PKC激活劑和PKC抑制劑進行處理細胞時，使HL-1心肌細胞生長至90%融合，饑餓處理12h后，加入PDB、白屈菜紅堿(chelerythrine，Chele)。

4.Western blot法檢測:收集心肌細胞，提取總蛋白，BioRad蛋白分析測得樣品蛋白濃度。將相同質量的蛋白(50～100μg/lane)加于SDS-PAGE膠，經電泳分離蛋白后，經轉膜，封閉，孵育相應一抗，PBST洗膜，孵育相應二抗，PBST洗膜后經ECL系統(tǒng)發(fā)光、顯影。

結 果

1.激活PKC誘導Gal-3在心肌細胞的表達:分別用濃度為10-9、10-8、10-7和10-6mol/L的PKC激活劑PDB來刺激HL-1心肌細胞，24h后，收集蛋白，檢測Gal-3的表達水平，24h后，Gal-3表達隨著PDB濃度的增加而增加。選用PKC激活劑PDB和抑制劑Chele分別激活和抑制Gal-3，RIPA裂解細胞收集蛋白，Western blot法檢測可見PDB組Gal-3表達顯著增加54%(P=0.000),PKC抑制劑Chele降低Gal-3蛋白表達79%(P=0.000)，詳見圖1。

圖1 激活PKC誘導半乳凝集素-3在心肌細胞(HL-1)表達A.不同濃度的PDB刺激心肌細胞，收集蛋白，應用Western blot法檢測半乳凝集素-3表達量；B.分別用二丁酸佛波醇酯、白屈菜紅堿刺激心肌細胞，收集蛋白，應用Western blot法檢測半乳凝集素-3表達量；與對照組比較，*P<0.05,**P=0.000，n=4

2.高表達Gal-3基因誘導膠原蛋白沉積:當6孔板的細胞生長至90%融合后，按說明書進行p3xFLAG-Gal-3質粒1微克/孔的轉染，48h后進行Western blot法檢測Gal-3的表達水平。高表達Gal-3基因誘導Ⅰ型膠原蛋白積累增加58%(P<0.01，n=3)，詳見圖2。

圖2 高表達Gal-3基因誘導膠原蛋白沉積HL-1細胞轉染p3xFLAG-Gal-3，收集蛋白，Western blot法檢測半乳凝集素-3、Ⅰ型膠原蛋白表達水平；與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,n=3

3.PKC誘導心肌細胞膠原沉積:待細胞長至90%融合，饑餓處理12h，按照Lipofectamine 2000說明書進行pcDNA3-PKC-α質粒的轉染，48h后通過Western blot法檢測PKC的表達水平(P<0.05)。如圖3所示，表達PKC基因誘導Ⅰ型膠原蛋白積累增加54%(P<0.01)。

圖3 PKC誘導心肌細胞膠原沉積HL-1細胞轉染pcDNA3-PKC-α，Western blot法檢測蛋白激酶C、Ⅰ型膠原蛋白的表達水平;與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,n=3

4.抑制Gal-3下調PKC誘導的心肌細胞膠原沉積:高表達的Gal-3可誘導心肌細胞膠原沉積，為進一步研究Gal-3是否介導PKC誘導膠原沉積的過程，應用Gal-3抑制劑β-乳糖50mmol/L和PKC激活劑PDB 2μmol/L處理心肌細胞6h；第4組先應用β-乳糖50mmol/L處理心肌細胞2h，再用PDB 2μmol/L處理心肌細胞。Western blot法檢測可見抑制Gal-3下調PKC誘導的心肌細胞膠原沉積降低24%(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 抑制Gal-3下調PKC誘導的心肌細胞膠原沉積HL-1細胞分別應用β-乳糖、二丁酸佛波醇酯以及β-乳糖+二丁酸佛波醇酯處理心肌細胞,收集蛋白，Western-blot法檢測半乳凝集素-3、Ⅰ型膠原蛋白的表達水平;與對照組比較，*P<0.05,*P=0.000,n=5

討 論

PKC是由Nishizuka等于1977年首次發(fā)現的一組磷脂依賴性激酶。PKC分為3類12種同工酶，第1類為經典型PKC，第2類為新型PKC，第3類為不典型PKC，不同亞型在機體組織的分布也不同。心肌細胞表達多種PKC亞型，PKC參與調節(jié)生物體多種病理生理過程[11]。然而心肌肥厚時心肌細胞內表達增加的主要是PKC信號蛋白，這說明PKC在心臟病理改變時發(fā)揮重要作用。心力衰竭動物模型實驗發(fā)現PKC過表達可引起心肌肥大和心功能障礙，由此證明PKC 參與了心肌纖維化過程[12]。PKC在心肌纖維化和心力衰竭發(fā)病過程中的促進作用已經被證實，然而其參與的信號通路和發(fā)病機制目前尚未清楚。研究發(fā)現，一些特殊物質如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶 (ERK)、糖原合成酶激酶(GSK)均為PKC的靶向作用物質，并且這些物質均參與心肌纖維化過程[13～15]。

Gal-3是動物凝集素家族中的一員，屬于鈣的非依賴性糖結合蛋白，是人類基因組中唯一的嵌合型半乳糖凝集素[16]。心肌重構是心室結構和功能變化的病理過程，是心力衰竭的前期階段，是病變發(fā)展和預后不良的決定性因素。心肌纖維化是心肌重構發(fā)生、發(fā)展的關鍵，然而，Gal-3 是心肌纖維化的關鍵介質，通過介導心肌細胞外基質逐漸促進心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。最近實驗表明Gal-3通過多種途徑誘發(fā)心力衰竭，例如通過轉化生長因子β介導心肌膠原纖維不對稱的沉積[17]；誘導纖維母細胞轉化為肌成纖維細胞，增加心肌細胞外膠原的沉積；降低細胞內的抗氧化能力，增加細胞的凋亡，這些機制促進心肌纖維化，心肌重構，最終發(fā)展為心力衰竭。Gal-3參與心臟、肝臟等各器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展，并最終發(fā)展為器官衰竭[18，19]。

以上實驗證明了PKC和Gal-3在心力衰竭心肌纖維化的過程中起了關鍵性作用。兩者都是通過促進膠原蛋白的沉積來促進心力衰竭的發(fā)展，但兩者在心力衰竭發(fā)展過程中的關系尚未清楚，筆者通過體外實驗發(fā)現，PKC對Gal-3的表達具有促進作用，并且Gal-3的表達與PKC的濃度呈正相關，但兩者之間具體調節(jié)機制尚不清楚，本實驗通過抑制Gal-3的表達發(fā)現PKC對膠原蛋白沉積的誘導作用減弱。

許多實驗已經證實Gal-3激活或表達增加與心力衰竭密切相關，實驗發(fā)現PKC對Gal-3的調節(jié)在心肌纖維化和心力衰竭發(fā)展過程中起著關鍵作用[20]。因此提出增加PKC可以促進Gal-3的表達，進而促進心肌纖維化和心力衰竭的發(fā)展。本實驗是在現有研究基礎之上的進一步拓展，提出存在PKC-Gal-3通路，且該通路在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。而此通路可能為預防、延緩或治療心力衰竭提供新的理論依據，然而對于此通路的其他調節(jié)尚不明確，因此需要進一步探究是否還有其他物質直接參與該通路的調節(jié)。