高 曉 沈莉菁 劉嘉穎 李 香

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)好發(fā)于青少年，以常伴縱膈巨塊，胸腔積液，易浸潤中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、脾臟等組織，進(jìn)展兇險，常規(guī)化療不敏感著稱。其發(fā)病機(jī)制涉及多種基因突變、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和表觀遺傳因子改變[1]。近年來，隨著化療、免疫治療及造血干細(xì)胞移植等綜合治療手段的發(fā)展，T-ALL患者的整體生存率有所改善，但仍有相當(dāng)部分患者為復(fù)發(fā)難治[2,3]。因此，迫切需要尋找更有效的治療靶點。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞組蛋白乙?；礁叩腡-ALL患者，提示預(yù)后較好[4]。但多數(shù)患者存在組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)的異常高表達(dá)，導(dǎo)致組蛋白乙?；捷^低，因此，筆者推測HDAC可能是T-ALL的潛在治療靶點[5]。本研究旨在通過公共數(shù)據(jù)庫挖掘與分析T-ALL中HDAC各亞型的表達(dá)情況，針對異常高表達(dá)HDAC亞型，選用選擇性HDAC抑制劑西達(dá)本胺進(jìn)行體外實驗，探討西達(dá)本胺對T-ALL細(xì)胞株的作用及可能的分子機(jī)制，為HDAC抑制劑在T-ALL的臨床應(yīng)用，提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料：人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株A3和Molt-4(上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。西達(dá)本胺由深圳微芯生物科技股份有限公司惠贈；二甲基亞砜(DMSO)購自美國MP Biomedicals公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為凱基生物公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑、細(xì)胞裂解液NP-40、Pierce ECL蛋白發(fā)光底物試劑盒為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，兔抗GAPDH、乙?；疕3K9(acetylated H3K9，Ac H3K9)、Mcl-1、BAX、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、剪切型PARP(cleaved PARP)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2, p-ERK1/2)單克隆抗體，鼠抗Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 (cysteinylasparate specific proteinase 9, caspase-9)單克隆抗體，山羊抗兔、山羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；西達(dá)本胺溶于DMSO配制成10mmol/L儲存液，-20℃保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度，使DMSO終濃度<1%。

2.方法:(1)數(shù)據(jù)庫挖掘和分析：Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)中分別檢索HDAC1-11亞型在急性白血病與正常對照組中的表達(dá)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。(2)細(xì)胞培養(yǎng)：A3和Molt-4細(xì)胞均使用同一批次含10%胎牛血清、1% 100U/L青霉素、1% 100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔1～2天更換培養(yǎng)液1次，倒置相差顯微鏡下觀察，維持密度在(2～10)×105/ml。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。(3)CCK-8檢測A3和Molt-4細(xì)胞增殖活力：取對數(shù)生長期的A3和Molt-4細(xì)胞株，按1×104個/孔細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置空白組、對照組及實驗組(西達(dá)本胺以100μmol/L為起始濃度，3倍梯度稀釋，使終濃度分別為0.045、0.130、0.410、1.200、3.700、11.000、33.000、100.000μmol/L)，每孔總體積為100μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育24、48、72h后，每孔避光加入10μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2.5h后，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件計算藥物的IC50。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測A3和Molt-4細(xì)胞凋亡:取對數(shù)生長期的A3和Molt-4細(xì)胞株于6孔板，每孔接種細(xì)胞3×105個，實驗組加入西達(dá)本胺使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0μmol/L，同時設(shè)置對照組，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h。離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，各組加入150μl Binding buffer重懸細(xì)胞后，實驗組依次加入Annexin V-FITC和PI各5μl(Annexin V-FITC單染管只加入5μl Annexin V-FITC，PI單染管只加入5μl PI)混勻后室溫避光孵育15min，最后各組再加入350μl Binding buffer輕輕混勻，1h內(nèi)上機(jī)檢測。(5)免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測組蛋白H3K9乙?；?、凋亡及ERK/MAPK信號通路蛋白水平：實驗組西達(dá)本胺(終濃度為0.5、1.0、2.0μmol/L)分別處理A3和Molt-4 48h，同時設(shè)置對照組，PBS洗滌2次后收集細(xì)胞，加入含1%蛋白酶抑制劑cocktail的NP-40細(xì)胞裂解液提取總蛋白，冰上裂解30min后超聲3次，5秒/次，收集總蛋白上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加樣至4%～10%的梯度SDS-PAGE凝膠中，經(jīng)電泳、濕轉(zhuǎn)至NC膜、5% BSA封閉、一抗4℃孵育過夜、TBST洗膜3次、二抗孵育、TBST洗膜3次后，ECL顯影成像。使用Image J軟件對各條帶進(jìn)行灰度分析，并以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.HDAC1～11各亞型在T-ALL患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)情況：本研究通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)進(jìn)行深入挖掘，分析比較急性髓性白血病、急性B淋巴細(xì)胞白血病、T-ALL患者相對于正常對照組中HDAC1～11各亞型的表達(dá)情況。Ⅰ類HDAC1、2、3和Ⅱ類HDAC9、10在T-ALL組表達(dá)水平較正常對照組顯著升高(HDAC1:t=8.398，P=2.38×10-7；HDAC2:t=6.976，P=2.41×10-6；HDAC3:t=3.359，P=0.002；HDAC9:t=6.814，P=5.55×10-6；HDAC10:t=9.493，P=6.72×10-8)；HDAC5、6、8、11表達(dá)水平在T-ALL中與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.西達(dá)本胺對T-ALL細(xì)胞株增殖的影響：本研究使用選擇性HDAC抑制劑西達(dá)本胺(靶點為HDAC1、2、3、10)和T-ALL細(xì)胞株A3、Molt-4進(jìn)行后續(xù)實驗。西達(dá)本胺(終濃度為0.045、0.130、0.410、1.200、3.700、11.000、33.000、100.000μmol/L)分別處理A3和Molt-4細(xì)胞株24、48、72h后，兩種細(xì)胞存活率均隨藥物濃度和處理時間的增加而明顯降低(P<0.05，圖1)，呈時間-濃度依賴性。西達(dá)本胺作用A3和Molt-4細(xì)胞株24h后的IC50值分別為2.24±0.18μmol/L和1.68±0.32μmol/L，48h的IC50值分別為0.66±0.10μmol/L和0.61±0.04μmol/L，72h的IC50值分別為0.29±0.13μmol/L和0.43±0.20μmol/L。

圖1 CCK-8檢測不同濃度西達(dá)本胺處理后A3和Molt-4細(xì)胞增殖曲線A.A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=3)

3.西達(dá)本胺對T-ALL細(xì)胞株組蛋白H3K9的乙酰化水平的影響：本研究使用0.5、1.0、2.0μmol/L西達(dá)本胺分別處理A3和Molt-4細(xì)胞48h，組蛋白H3K9的乙?；骄^基線明顯升高，呈濃度依賴(P<0.05，圖2)。

圖2 Western blot法檢測不同濃度西達(dá)本胺對A3和Molt-4細(xì)胞組蛋白H3K9乙酰化水平的影響Ac H3.乙?；慕M蛋白H3K9；H3.內(nèi)參蛋白；與0μmol/L比較，*P<0.01(n=3)

4.西達(dá)本胺對T-ALL細(xì)胞株凋亡的影響：0.5、1.0、2.0μmol/L西達(dá)本胺分別作用于細(xì)胞株A3和Molt-4 48h后，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。西達(dá)本胺誘導(dǎo)A3細(xì)胞凋亡的比率隨濃度增加而遞增(圖3A)，分別為14.60%±0.89%、17.11%±1.96%、26.51%±1.18%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Molt-4細(xì)胞獲得了類似結(jié)果(圖3B)，分別為4.74%±1.20%、5.76%±1.36%、10.48%±0.91%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度西達(dá)本胺對A3和Molt-4細(xì)胞凋亡的影響A.A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01(n=3)

5.西達(dá)本胺誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞株凋亡的可能機(jī)制：0.5、1.0、2.0μmol/L西達(dá)本胺分別作用于細(xì)胞株A3和Molt-4 48h后，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1均顯著下調(diào)(P均<0.05)，促凋亡蛋白BAX、線粒體凋亡途徑蛋白活化型caspase-9、剪切型PRAP均顯著上調(diào)(P均<0.05，圖4)。Western blot法檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的ERK/MAPK信號通路蛋白，與對照組比較，p-ERK1/2蛋白水平均明顯降低(P均<0.05)，且0.5μmol/L的西達(dá)本胺即可明顯下調(diào)A3細(xì)胞株的p-ERK1/2蛋白水平(P<0.05,圖5)。

圖4 Western bolt法檢測不同濃度西達(dá)本胺對A3和Molt-4細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響A.A3;B.Molt-4;Cleaved caspase-9.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；Cleaved PARP.剪切型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；以各凋亡蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)水平；A:A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.01(n=3)

圖5 Western bolt法檢測不同濃度西達(dá)本胺對A3和Molt-4細(xì)胞中ERK1/2通路蛋白表達(dá)的影響A.A3;B.Molt-4;ERK1/2 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；p-ERK1/2 磷酸化ERK1/2；以各通路蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)水平；與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01(n=3)

討 論

組蛋白乙?；谌旧w重塑和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性方面發(fā)揮重要作用，主要受HDAC和組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶的共同調(diào)節(jié)。其中，HDAC可降低組蛋白的乙酰化水平，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得致密從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

HDAC異常高表達(dá)與T-ALL的發(fā)生有著密切的關(guān)系。文獻(xiàn)報道，急性白血病患者中組蛋白低乙?；⑴c不良預(yù)后相關(guān)[5]；Gruhn等研究發(fā)現(xiàn)，與正常骨髓和外周血比較，ALL患者中Ⅰ類HDAC1、2、8高表達(dá)，這解釋了之前研究中組蛋白低乙?；慕Y(jié)果；此外，Moreno等發(fā)現(xiàn)HDAC1和2高表達(dá)與T細(xì)胞表型相關(guān)；Cardoso等[6]發(fā)現(xiàn)T-ALL患者可經(jīng)染色體易位使轉(zhuǎn)錄因子TAL1過表達(dá)，進(jìn)而招募含HDAC1的復(fù)合物促進(jìn)T-ALL的發(fā)生。以上研究結(jié)果均提示Ⅰ類HDAC在T細(xì)胞白血病的發(fā)生中扮演著重要角色，也為T-ALL的治療提供了新思路。本研究通過數(shù)據(jù)庫挖掘分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ類HDAC1、2、3和Ⅱ類HDAC9、10在T-ALL中顯著高表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致。

HDAC抑制劑具有廣泛的抗腫瘤能力和較低的毒副作用，因此，臨床上常作為多種血液腫瘤及實體瘤常規(guī)放、化療手段的補(bǔ)充[7～9]。我國自主研發(fā)的新型HDAC抑制劑西達(dá)本胺主要針對ClassⅠ類的HDAC1、2、3以及Class Ⅱ類的HDAC10，目前的臨床適應(yīng)癥為復(fù)發(fā)難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤。其作用機(jī)制和療效，與腫瘤類型密切相關(guān)[10,11]，總體上可通過增加組蛋白H3和H4，以及非組蛋白p21、p53、C-MYC等乙酰化水平，調(diào)控相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)腫瘤的分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用，但在T-ALL中具體作用及機(jī)制研究較少。

本研究中西達(dá)本胺不僅對細(xì)胞株A3和Molt-4的增殖有明顯的抑制作用，而且在不同時間點的IC50接近，抑制作用均呈濃度、時間依賴性的方式。隨著西達(dá)本胺濃度的增加，T-ALL細(xì)胞株中組蛋白H3K9乙酰化水平明顯增加，提示在表觀遺傳方面，西達(dá)本胺可有效抑制HDACs，增加組蛋白乙?；健３种瓢籽〖?xì)胞株增殖外，本研究選取西達(dá)本胺48h IC50左右的濃度進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測，發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺可顯著誘導(dǎo)A3和Molt-4細(xì)胞的凋亡，且隨濃度而遞增。

在凋亡信號傳遞過程中，Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白共同影響線粒體膜的通透性，調(diào)控細(xì)胞色素C等細(xì)胞因子釋放，激活caspase-9，再激活下游caspase效應(yīng)分子,切割多種蛋白分子，如DNA損傷修復(fù)蛋白PARP，執(zhí)行細(xì)胞凋亡的生物功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，西達(dá)本胺可明顯下調(diào)細(xì)胞株A3和Molt-4中抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1，上調(diào)促凋亡蛋白BAX、活化型caspase-9和剪切型PARP蛋白表達(dá)，這表明西達(dá)本胺可經(jīng)線粒體途徑介導(dǎo)T-ALL細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞的生長受到多種細(xì)胞外信號調(diào)控，調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡的經(jīng)典信號通路促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)，受特定蛋白(ERK1/2、JNK、p38)的磷酸化活化形式介導(dǎo)，是多種腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。在T-ALL中，ERK1/2/MAPK信號通路的異常激活是主要發(fā)病機(jī)制之一，而JNK/MAPK或p38/MAPK信號通路在T-ALL中無明顯異常改變[13]。T-ALL患者很少發(fā)生ERK突變，但大約35%的成人T-ALL患者存在ERK1/2的持續(xù)激活，且與高白細(xì)胞數(shù)、對類固醇類藥物反應(yīng)差等不良預(yù)后因素有關(guān)[14]。ERK1/2的過度活化可影響腫瘤細(xì)胞的凋亡信號傳遞，主要通過間接影響細(xì)胞增殖通路NF-κB以及直接調(diào)控凋亡蛋白和caspase依賴的凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15,16]。因此，ERK1/2信號通路受抑可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，西達(dá)本胺可明顯下調(diào)細(xì)胞株A3和Molt-4中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，因此，筆者推測西達(dá)本胺誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞凋亡的作用，可能與抑制ERK1/2信號通路的活化有關(guān)。

綜上所述，針對T-ALL中高表達(dá)的Ⅰ類和Ⅱ類HDACs，本研究通過體外細(xì)胞實驗表明西達(dá)本胺能有效抑制T-ALL細(xì)胞株A3和Molt-4細(xì)胞的增殖，增加組蛋白H3K9乙?；剑⑼ㄟ^調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)和激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制ERK/MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，這為選擇性HDAC抑制劑用于治療T-ALL提供了部分理論和實驗依據(jù)。