王西強，楊丹丹，劉靜，范修德，馬愛群，4，5，劉平

（1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710061；2.浙江大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，杭州 310000；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，西安 710061；4.陜西省分子心臟病學重點實驗室，西安交通大學，西安 710061；5.環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室，西安 710061）

在冠狀動脈病變的基礎上，斑塊破裂、血栓碎片釋放入血，內(nèi)源性和外源性凝血途徑啟動，以及隨后冠狀動脈內(nèi)血栓形成，是急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展的病理生理學基礎，其中中性粒細胞發(fā)揮了重要作用［1-2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化的進程中，循環(huán)中性粒細胞及構(gòu)成血管壁的細胞DNA更容易受到損傷，受損細胞通過細胞程序性死亡釋放出大量胞外DNA和核小體。通過這種特殊的細胞程序性死亡［4］，中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等釋放出球狀顆粒串于絲狀纖維上，并相互纏繞成網(wǎng)狀陷阱樣結(jié)構(gòu)，即中性粒細胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs），并促進急性心肌梗死時冠狀動脈內(nèi)血栓形成。NETs結(jié)構(gòu)上的絲狀纖維主要由細胞核內(nèi)的DNA 去致密化而來，為非濃縮的雙鏈脫氧核苷酸（double-stranded DNA，dsDNA）纖維，絲狀纖維dsDNA構(gòu)成了NETs的骨架結(jié)構(gòu)［4-5］。有研究［6-9］發(fā)現(xiàn)，NETs具有重要的抗感染作用，并在自身免疫性疾病、腫瘤、深靜脈血栓、敗血癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。近期，BORISSOFF等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈粥樣硬化疾病狀態(tài)下，由體內(nèi)免疫細胞釋放的dsDNA與嚴重冠狀動脈粥樣硬化性患者的預后相關，并且可能是促進冠狀動脈粥樣硬化心臟病發(fā)生的病理生理基礎。但dsDNA是否與急性ST段抬高型心肌梗死（acute ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）發(fā)生相關仍屬未知。本研究擬通過分析STEMI患者dsDNA含量與心肌梗死相關指標，探討dsDNA與STEMI發(fā)生的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2015年6月至12月發(fā)病12 h內(nèi)入住西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科重癥監(jiān)護室的STEMI患者共145例，以及健康對照者3例。標本采集前告知并征得研究對象或其委托人同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并在其監(jiān)督下完成。

納入標準：根據(jù)最新中國STEMI診斷及治療指南［11］診斷為STEMI，發(fā)病12 h內(nèi)，并接受急診冠狀動脈支架植入術(shù)開通罪犯血管的患者。排除標準：伴腎功能不全且血清肌酐＞ 20 mg/L；伴肝炎、肝硬化，近期出現(xiàn)或持續(xù)存在的肝功能異常；伴骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、潰瘍性腸病、肌炎/肌病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等系統(tǒng)性疾病；有瓣膜性心臟病、持續(xù)性心房纖顫等心血管疾??；不同意及不配合完成本研究者。

1.2 研究方法

1.2.1 記錄基線資料：包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、既往病史等基本資料。

1.2.2 采集標本：STEMI患者入院后立即于橈動脈或股動脈處取外周動脈血，于術(shù)中采集梗死相關冠狀動脈血；采集健康對照者外周動脈血。采用EDTA抗凝管取血。

1.2.3 檢查生化指標：抽血后立即送檢血常規(guī)、肝腎功、心肌酶譜、肌鈣蛋白、血脂全套等常規(guī)檢查，使用Sysmex XE-5000全自動血液分析儀及配套試劑進行檢測。

1.2.4 分離STEMI患者冠狀動脈血、外周動脈血及正常人外周血中性粒細胞：采用中性粒細胞分離試劑盒進行分離。向15 mL離心管中加入試劑A 5 mL，向分離液液面上加入血液標本，500～550g高速離心10 min，可見離心管中標本分為單個核細胞層及中性粒細胞層，吸取離心管中中性粒細胞。若中性粒細胞中混雜有紅細胞，則加入紅細胞裂解液，即可得目的細胞。轉(zhuǎn)移目的細胞至一新的15 mL離心管，并加入10 mL清洗液，250g高速離心10 min，獲得目的細胞。

1.2.5 免疫熒光染色觀察STEMI患者梗死相關動脈、外周動脈及健康對照者外周動脈NETs結(jié)構(gòu)并計數(shù)分析：4%多聚甲醛固定中性粒細胞30 min，用0.1%TX-100作用于中性粒細胞5 min，使細胞膜通透，用BSA封閉1 h，一抗孵育過夜。用PBS清洗細胞，使用DAPI對中性粒細胞細胞核進行著色，封片，使用熒光顯微鏡觀察NETs結(jié)構(gòu)，對不同視野下NETs結(jié)構(gòu)進行計數(shù)，并計算NETs結(jié)構(gòu)占總細胞數(shù)比例。

1.2.6 檢測梗死相關動脈及外周動脈血漿中NETs相關結(jié)構(gòu)dsDNA含量：使用熒光染料Sytox Green DNA檢測。將標準品與樣品按照試劑盒說明書稀釋后，用含有0.1%BSA的PBS將血漿標本稀釋50倍，用100 μL熒光染料與等體積的稀釋樣品混合后，加入96孔板中，最終標準品的終濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625，0 μg/mL。在激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為525 nm處，使用熒光讀數(shù)儀檢測信號強度，標本加完后盡快上機，以防止熒光淬滅。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)表示。2組計量資料符合正態(tài)分布及方差齊性的比較采用兩獨立樣本t檢驗，2組計量資料不符合正態(tài)分布與方差齊性的比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。滿足雙變量正態(tài)分布資料采用Pearson相關系數(shù)分析；不滿足雙變量正態(tài)分布或等級資料采用Spearman相關分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STEMI患者基線資料

入組STEMI患者的基線資料見表1。

2.2 免疫熒光染色結(jié)果

梗死相關冠狀動脈中可見大量NETs骨架結(jié)構(gòu)生成，見圖1。選取不同視野計數(shù)NETs骨架結(jié)構(gòu)占總細胞數(shù)比例并進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，STEMI患者梗死相關冠狀動脈中NETs骨架結(jié)構(gòu)（32.33%±4.6%）明顯多于STEMI患者外周動脈及健康對照者外周動脈（17.87%±1.017%，7.55%±1.95%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037，P=0.027），見圖2。

2.3 免疫酶標儀定量分析結(jié)果

表1 STEMI患者基線資料Tab.1 Clinical baseline data in STEMI patients

圖1 免疫熒光染色觀察NETs的生成 ×20Fig.1 Analysis NETs formation by immunofluorescence staining ×20

圖2 梗死相關冠狀動脈、外周動脈及健康對照者外周動脈NETs生成量Fig.2 Neutrophil extracellular traps of polymorphonuclear neutrophils obtained from infarct-related coronary artery，peripheral artery，and control peripheral artery

用熒光分光光度儀測定標準品和外周動脈血游離dsDNA含量，繪制標準曲線，R2=0.998 1，見圖3。STEMI患者冠狀動脈中dsDNA含量明顯高于STEMI患者外周動脈，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.038）。

圖3 dsDNA標準曲線Fig.3 Standard curve of dsDNA

2.4 dsDNA與心肌梗死相關指標的散點圖分析

dsDNA與磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、肌鈣蛋白T（troponin T，cTnT）、白細胞（white blood cell，WBC）檢測結(jié)果行散點圖分析，結(jié)果見圖4。

2.5 dsDNA與心肌梗死相關指標的相關性分析

圖4 磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白T、白細胞計數(shù)與dsDNA散點圖Fig.4 Scatter chart of dsDNA and CK，CK-MB，cTnT and WBC

相關性分析結(jié)果顯示，CK、CK-MB、cTnT、WBC與dsDNA含量呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

3 討論

STEMI是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者死亡的主要原因［12-13］，其發(fā)生機制尚不清楚［1，14］。研究顯示，循環(huán)中的WBC，特別是單核細胞在動脈粥樣硬化血栓形成過程中起重要作用［15］，且中性粒細胞是急性心肌梗死患者死亡的獨立預測因子［16］；中性粒細胞在急性心肌梗死患者冠狀動脈血栓中大量聚集［17］，并且是預測急性心肌梗死患者遠期預后的重要指標［17-19］。但中性粒細胞如何參與上述疾病的發(fā)生仍有待進一步探討。

表2 心肌梗死相關指標與外周動脈血漿dsDNA相關性分析Tab.2 Correlation between dsDNA and indicators of myocardial infarction

既往研究［4］顯示，中性粒細胞可以通過形成NETs捕獲并殺滅病原體。近期的研究［20］發(fā)現(xiàn)，NETs不僅對感染性疾病具有保護作用，而且還在動脈粥樣硬化以及動脈粥樣硬化血栓形成中具有重要作用。本研究檢測了STEMI患者梗死相關冠狀動脈、外周動脈血中NETs骨架結(jié)構(gòu)、dsDNA含量，結(jié)果顯示，STEMI患者梗死相關冠狀動脈血中NETs骨架結(jié)構(gòu)明顯多于STEMI患者外周動脈及健康對照者外周動脈，且STEMI患者冠狀動脈中NETs骨架結(jié)構(gòu)dsDNA含量明顯高于STEMI患者外周動脈，差異有統(tǒng)計學意義。并對dsDNA含量與心肌酶譜、cTnT、WBC等提示STEMI發(fā)生的相關性指標行相關性分析，結(jié)果顯示，CK、CK-MB、cTnT、WBC與血漿中dsDNA呈正相關，且差異有統(tǒng)計學意義，提示中性粒細胞可能以NETs的形式參與了STEMI的發(fā)生，NETs的骨架結(jié)構(gòu)dsDNA可能與STEMI的發(fā)生相關，可能為治療STEMI提供新的思路與靶點。

研究［20］發(fā)現(xiàn)，應用動脈粥樣硬化小鼠模型，可見中性粒細胞在膽固醇結(jié)晶的刺激誘導下形成NETs，巨噬細胞被NETs激活并分泌相關細胞因子，如白細胞介素-1β，在相關細胞因子的作用下，輔助性T細胞17被激活，擴大免疫細胞在粥樣硬化灶的聚集，引起慢性炎癥反應，為NETs參與冠狀動脈粥樣硬化的形成、斑塊炎癥活動提供了可能的機制。研究［21］顯示，過度產(chǎn)生的循環(huán)DNA、核小體和組蛋白等NETs相關結(jié)構(gòu)在血栓形成、肺炎以及敗血癥中能夠促進疾病的發(fā)展，加重病情。由于強有力的細胞毒和促血栓形成作用，胞外DNA可能是炎癥和血栓形成之間的橋梁。而且在急性心肌梗死中，中性粒細胞可釋放NETs，并暴露有活性的組織因子，激活外源性凝血途徑，從而促進急性心肌梗死時血栓的形成［22］。在動脈粥樣硬化中，膽固醇刺激NETs的生成，NETs參與并擴大慢性炎癥反應，胞外DNA作為炎癥和血栓之間的橋梁，促進急性心肌梗死時血栓形成，可能是NETs致STEMI發(fā)生的主要機制。因此，中性粒細胞可能以NETs的形式參與了STEMI的發(fā)生。