徐杰，張一楊，馬玉，賈云鵬，杜瑩，馮福民

（華北理工大學公共衛(wèi)生學院河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點實驗室，河北 唐山 063000）

結(jié)核病是全球第九大致死疾病，患者主要死因為單一病原體感染造成［1］。世界衛(wèi)生組織推薦的標準抗結(jié)核治療方案是將異煙肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampin，RFP）、吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）作為不可替代的一線抗結(jié)核藥物，但用藥后可導致患者產(chǎn)生明顯的抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberclosis drug-induced liver injury，ADLI）［2］。目前，ADLI的發(fā)生機制尚不明確，隨著對其研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在肝細胞損傷后，打破了組蛋白乙?；福╤istone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）之間動態(tài)平衡，造成炎性細胞因子等異常表達［3］。已有研究［4-8］顯示HDAC沉默信息調(diào)節(jié)因子-1（silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1）與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）在肝臟炎癥等損傷中起重要作用，且NF-κB是SIRT1的靶分子，能夠調(diào)控下游炎性細胞因子IL-6、TNF-α的表達。故推測HDAC SIRT1可能通過作用于NF-κB信號通路調(diào)控ADLI過程中炎癥反應的發(fā)生。

本研究在INH、RFP、PZA致人肝細胞損傷模型中觀察SIRT1的表達變化，并分別給予特異性SIRT1激動劑、抑制劑干預，觀察其對炎性細胞因子的影響，進而探討SIRT1在不同的抗結(jié)核藥物致肝損傷過程中的作用，為ADLI治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人正常肝細胞株HL-7702購自上海中科院細胞所；異煙肼（批號YSMXE-OM）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；批號W3OKK-MI）購自日本TCI公司；青霉素與鏈霉素（批號1634678）購自德國BI公司；0.25%胰蛋白酶（批號25200-072）購自美國GIBCO公司；SIRT1激動劑SRT1720（批號S112906）和抑制劑EX527（批號S154103）均購自美國Selleck公司；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（批號AK4601）、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡPCR試劑盒（批號AK4602）購自大連寶生物工程有限公司；TRI pure Reagent 總RNA抽提試劑盒（批號0020161010）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ALT、AST試劑盒（批號20170301）購自南京建成生物工程研究所；SIRT1、NF-κB p65、TNF-α ELISA檢測試劑盒（批號201612）購自北京冬歌偉業(yè)生物技術(shù)有限公司；IL-6 ELISA檢測試劑盒（批號210660124）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。Heraeus高速冷凍離心機（德國Thermo Scientific公司）、CA94089型連續(xù)光譜酶標儀（美國Molecular Devices公司）、C1000PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）、實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將HL-7702細胞接種于含90%RPMI 1640、10%胎牛血清、1%雙抗培養(yǎng)液中，收集細胞懸液，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。對于未長滿的細胞進行隔天換液；對于生長密度達到培養(yǎng)瓶底部面積80%以上的細胞進行傳代處理。選取對數(shù)生長期細胞進行同細胞傳代，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，接種到6孔板上，每孔為2 mL，接種預培養(yǎng)24 h后給予相應處理，于48 h后收集細胞及培養(yǎng)液進行檢測。

1.2.2 細胞分組及干預：確定最佳藥物濃度（800 μg/mL INH、200 μg/mL RFP、400 μg/mL PZA）及SIRT1激動劑、抑制劑濃度（1 μmol/L SIRT1激動劑SRT1720、1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527）后，將細胞分為INH組、RFP組、PZA組3組。各組再分為以下亞組，空白對照組、藥物組、藥物+SIRT1激動劑（SRT1720）組、激動劑對照組、藥物+SIRT1抑制劑（EX527）組和抑制劑對照組。

1.2.3 細胞上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）含量檢測：收集細胞培養(yǎng)的上清液，嚴格按照ALT、AST檢測試劑盒說明書進行操作，測定ALT、AST含量。

1.2.4 肝細胞中SIRT1、NF-κB p65mRNA及其靶基因IL-6、TNF-α mRNA表達檢測：采用實時PCR方法測定，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。收集各組處理后的細胞用Trizol提取RNA，mRNA表達水平檢測以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計算mRNA表達水平；酶標儀檢測各組RNA樣本吸光度，OD260/OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)提示RNA純度較好。取RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。用SYBR Green嵌合熒光法進行實時PCR擴增。反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃5 s，4 ℃ 1 min。定量PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)，引物由上海生物工程公司負責設(shè)計與合成，引物序列見表1。

1.2.5 肝細胞中SIRT1、NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白含量檢測：采用Western blotting檢測肝細胞中SIRT1、NF-κB p65蛋白表達水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測肝細胞中IL-6、TNF-α蛋白表達水平，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝細胞形態(tài)學變化

HE染色后于光學顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，結(jié)果顯示，空白對照組、SIRT1激動劑對照組和SIRT1抑制劑對照組的肝細胞密集，形態(tài)正常，提示對照組細胞正常，肝細胞對激動劑和抑制劑無不良反應。而各藥物組肝細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)異常。聯(lián)用SIRT1激動劑后可減輕肝細胞損傷情況，而聯(lián)用SIRT1抑制劑則加重了細胞損傷。見圖1。

圖1 各組肝細胞形態(tài)學變化 HE×100Fig.1 Morphological changes of HL-7702 in the different treatment groups HE×100

2.2 各組細胞上清液中ALT和AST含量比較

與其空白對照組比較，INH組、RFP組、PZA組均引起上清液ALT、AST含量增加，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05），提示造模成功。SIRT1激動劑對照組和抑制劑對照組則與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），提示激動劑、抑制劑對人肝細胞無影響。INH、RFP、PZA分別聯(lián)用SIRT1激動劑，使ALT、AST含量降低；而聯(lián)用SIRT1抑制劑使ALT、AST含量升高（均P＜ 0.05），提示加入SIRT1激動劑可緩解抗結(jié)核藥物導致的肝細胞損傷，加入SIRT1抑制劑則加重了損傷發(fā)生。見表2～4。

2.3 各組細胞相關(guān)指標mRNA及蛋白表達變化

與其空白對照組比較，INH、RFP、PZA刺激均造成HL-7702細胞的SIRT1mRNA和蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05），提示SIRT1表達參與抗結(jié)核藥物致肝細胞損傷過程。其中INH組的NFκB p65、IL-6及TNF-αmRNA及蛋白表達與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）；而與空白對照組比較，RFP組與PZA組各指標差異無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05），提示INH組細胞出現(xiàn)了炎癥損傷，而RFP組和PZA組細胞的炎癥損傷并不明顯。SIRT1激動劑對照組和抑制劑對照組與空白對照組相關(guān)指標比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05），提示SIRT1激動劑及抑制劑對細胞無影響。

表2 INH各亞組細胞上清液中ALT、AST含量（pg/mL）Tab.2 ALT and AST levels in the supernatant of each subgroups treated with isoniazid（pg/mL）

表3 RFP各亞組細胞上清液中ALT、AST含量（pg/mL）Tab.3 ALT and AST levels in the supernatant of each subgroups treated with rifampin（pg/mL）

表4 PZA各亞組細胞上清液中ALT、AST含量（pg/mL）Tab.4 ALT and AST levels in the supernatant of each subgroups treated with pyrazinamide（pg/mL）

與INH組比較，INH+SRT1720組NF-κB p65、IL-6及TNF-αmRNA及蛋白表達均減少（均P＜ 0.05），提示SIRT1的激活可以減輕細胞炎癥損傷。而INH+EX527組與INH組比較NF-κB p65、IL-6及TNF-αmRNA及蛋白表達均增加（均P＜ 0.05），說明SIRT1的抑制可加重細胞炎癥損傷。見表5～10，圖2～4。

表5 INH各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達比較Tab.5 Relative expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 mRNA in the cells of each subgroups treated with isoniazid

表6 RFP各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達比較Tab.6 Relative expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 mRNA in the cells of each subgroups treated with rifampin

表7 PZA各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達比較Tab.7 Relative expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 mRNA in the cells of each subgroups treated with pynazinamide

表8 INH各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白表達情況Tab.8 Protein expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 in the cells of each subgroups treated with isoniazid

表9 RFP各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白表達情況Tab.9 Protein expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 in the cells of each subgroups treated with rifampin

表10 PZA各亞組細胞SIRT1、NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白表達情況Tab.10 Protein expressions of SIRT1，NF-κB，TNF-α，and IL-6 in the cells of each subgroups treated with pyrazinamide

圖2 INH各亞組細胞中SIRT1、NF-κB蛋白表達比較Fig.2 Comparison of SIRT1 and NF-κB protein expressim in cells of each subgroups treated with isoniazid

圖3 RFP各亞組細胞中SIRT1、NF-κB蛋白表達比較Fig.3 Comparison of SIRT1 and NF-κB protein expression in cells of each subgroups treated with rifampin

圖4 PZA各亞組細胞中SIRT1、NF-κB蛋白表達比較Fig.4 Comparison of SIRT1 and NF-κB protein expression in the cells of each subgroups treated with pyrazinamide

3 討論

一線抗結(jié)核藥物INH、RFP和PZA最嚴重且最受臨床關(guān)注的不良反應就是ADLI，為此深入探討ADLI的發(fā)生機制就顯得尤為重要。SIRT1是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的Ⅲ型HDAC，且肝臟是SIRT1主要表達的器官之一［9］，已被證實它與細胞凋亡、抗氧化應激以及抑制炎癥等細胞的多種功能活動有關(guān)［10-13］。例如小鼠骨髓細胞特異性破壞SIRT1時，提示腹腔巨噬細胞缺乏SIRT1可誘導NF-κB過度乙?；黾痈闻KNF-κB轉(zhuǎn)錄激活，導致肝臟炎癥［14］。這些都提示SIRT1表達改變與肝損傷發(fā)生密切相關(guān)。本研究通過建立ADLI細胞模型，檢測SIRT1的表達水平發(fā)現(xiàn)，INH組、RFP組、PZA組中SIRT1表達水平與空白對照組比較均降低，證明SIRT1表達下調(diào)在ADLI發(fā)生機制中可能起著重要作用。

抗結(jié)核藥物代謝過程中出現(xiàn)炎癥反應越來越受到人們關(guān)注，這很可能為ADLI防治提供新的參考依據(jù)。目前，大多數(shù)觀點認為SIRT1可調(diào)控炎癥反應相關(guān)信號通路，但具體機制尚不清楚。NF-κB是SIRT1的靶分子，它能夠調(diào)控下游炎性細胞因子IL-6、TNF-α的表達。有研究［15］報道，SIRT1激活可抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導，促進炎癥消退。NLRP3炎癥小體通過NF-κB信號傳導參與了日本血吸蟲肝纖維化進程，進而影響下游炎性細胞因子的表達，提示NF-κB與肝臟疾病密切相關(guān)，并在炎癥發(fā)生中起著極其重要的作用［16］。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，INH、RFP、PZA 3組均可引起肝細胞損傷中SIRT1表達減少，但是只有INH組的NF-κB p65、IL-6及TNF-α的表達水平升高。為了觀察SIRT1表達變化對各組肝細胞炎癥損傷的影響，加入SIRT1激動劑后發(fā)現(xiàn)，只有INH組誘導的NF-κB p65呈現(xiàn)低表達，進而減少了IL-6、TNF-α等炎性細胞因子的產(chǎn)生；加入SIRT1抑制劑后，只有INH組誘導的炎性細胞因子NF-κB p65、IL-6、TNF-α的表達隨之升高。這表明INH組的細胞出現(xiàn)了炎癥損傷，而RFP與PZA組雖然導致SIRT1表達改變，但是其炎癥損傷并不明顯。故推測INH導致的人肝細胞炎癥損傷的機制可能是SIRT1通過作用于NF-κB p65信號通路進而影響IL-6、TNF-α等炎性細胞因子表達產(chǎn)生的。

AST和ALT是反映肝損害的敏感指標，可用于評估肝功能或肝損傷。本研究中ALT、AST的升高表示INH、RFP與PZA 3組細胞在抗結(jié)核藥物作用下出現(xiàn)了一定的肝損傷，加入SIRT1激動劑、抑制劑后觀察ALT、AST水平發(fā)現(xiàn)，人肝細胞損傷情況也隨之發(fā)生了改變。但觀察SIRT1表達對炎性細胞因子影響時卻發(fā)現(xiàn)，只有INH組出現(xiàn)了炎癥損傷，RFP、PZA組炎癥損傷不明顯。因此推測這很有可能與過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路有關(guān)。早有研究報道PPAR信號通路是SIRT1的調(diào)控靶點，SIRT1可以通過PPAR抑制脂肪細胞分化［17］，并且PPAR激動劑能夠影響人體內(nèi)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和能量平衡，使用幾種激動劑重復激活PPAR可以導致人肝素細胞減少，脂肪變性［18］。而RFP治療可顯著升高血漿ALT、AST水平，其組織病理學典型表現(xiàn)為肝脂肪變性［19］。還有研究［20］發(fā)現(xiàn)，PZA誘導肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，PPAR表達下調(diào)，與肝臟損傷程度呈顯著負相關(guān)。故推測SIRT1影響RFP、PZA組ALT、AST變化造成肝臟損傷是通過調(diào)控PPAR信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實SIRT1參與INH致人肝損傷的機制是通過作用于NF-κB p65信號通路進而影響炎性細胞因子的表達來實現(xiàn)的，并且SIRT1可能通過調(diào)控PPAR信號通路參與到RFP、PZA致人肝細胞損傷的過程中。本研究沒有考慮細胞系的多樣性，只運用人正常肝細胞系HL-7702進行了實驗，因此仍需在其他人正常肝細胞系中驗證相關(guān)機制，以便為ADLI的防治提供新依據(jù)。