鄒晶晶,朱小飛,余 楊

(1.焦作市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 焦作 454150；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌，其病率呈逐年升高趨勢(shì)，高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的主要病因[1-3]。HPV感染很普遍，大多數(shù)人可以自然消退，即使感染了高危亞型，也未必發(fā)展為癌。HPV誘發(fā)的宮頸病變的轉(zhuǎn)歸與宮頸局部微環(huán)境密切相關(guān)。免疫和炎癥是宮頸微環(huán)境的基本特征。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化由固有的基因改變決定，但腫瘤進(jìn)展受腫瘤微環(huán)境、炎癥和免疫反應(yīng)控制[4-6]。作為重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)通過(guò)分泌特異的細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫調(diào)控功能。在不同抗原的刺激下，Th可分化為Th1與Th2 亞群，2類細(xì)胞相互制約、交互調(diào)節(jié)，共同維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)，一旦平衡被打破，機(jī)體處于Th1優(yōu)勢(shì)或Th2優(yōu)勢(shì)，則導(dǎo)致各種病理反應(yīng)、病變趨向，甚至發(fā)生腫瘤。本研究通過(guò)比較宮頸病變不同階段局部微環(huán)境中Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)以及HR-HPV DNA對(duì)感染狀態(tài)的量化監(jiān)測(cè)，分析免疫、感染、局部微環(huán)境三者相互作用的多樣表現(xiàn)及其在宮頸癌和癌前病變的差異性；研究HR-HPV、Th1/Th2細(xì)胞因子的變化與宮頸病變發(fā)展趨勢(shì)的聯(lián)系；探討從炎癥到癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能的免疫學(xué)機(jī)制，為建立高級(jí)別CIN和宮頸癌的分流診治提供臨床支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇焦作市第二人民醫(yī)院2012年1月至2015年9月收治的339例HR-HPV持續(xù)性感染的不同宮頸病變患者為研究對(duì)象，其中CIN I 級(jí)71例(CIN I組)、CIN Ⅱ 級(jí)66例(CIN Ⅱ組)、CIN Ⅲ 級(jí)77例(CIN Ⅲ組)，宮頸癌125例(宮頸癌組)，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。所有患者入院前未接受宮頸物理治療、手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療；既往無(wú)其他系統(tǒng)腫瘤病史；無(wú)子宮切除手術(shù)史；無(wú)免疫系統(tǒng)缺陷疾病史；近期未使用過(guò)免疫抑制類藥物。患者本人均知情同意，隨訪資料完整。持續(xù)性HR-HPV感染的定義[7-8]：HR-HPV感染者第1年每4個(gè)月隨訪1次，以后至少6個(gè)月隨訪1次，持續(xù)2 a以上，同一患者的宮頸檢測(cè)樣本均顯示HR-HPV陽(yáng)性且為同種類型。另選擇HPV陰性且細(xì)胞學(xué)檢查為正常宮頸的40例健康體檢者作為對(duì)照組。CIN I組患者年齡 34～62(46.45±7.88)歲，CIN Ⅱ組患者年齡34～61(47.56±8.83)歲，CIN Ⅲ組患者年齡35～62(47.86±9.28)歲，宮頸癌組患者年齡34～62(47.05±8.60)歲，對(duì)照組受試者年齡34～62(46.55±9.36)歲；各組受試者年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.136，P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-4、IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；DA7600型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀、高危型HPV核酸定量(16、18、31、33、45、52、56、58共8個(gè)型)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司。

1.3 宮頸分泌物中HR-HPV DNA定量檢測(cè)無(wú)菌條件下采用宮頸刷插入受試者宮頸內(nèi)，旋轉(zhuǎn)數(shù)周后停留片刻取出，將宮頸刷置入無(wú)菌管。將采集的宮頸分泌物及時(shí)送檢或4 ℃保存，1周內(nèi)檢測(cè)。DNA提取和PCR擴(kuò)增具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 宮頸灌洗液中細(xì)胞因子的檢測(cè)將2 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)注入宮頸管內(nèi)，收集宮頸灌洗液。將采集的灌洗液3 500 r·min-1離心10 min，分離上清液，立即進(jìn)行檢測(cè)或置-20 ℃冰箱保存待測(cè)。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10的含量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 5組受試者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中細(xì)胞因子水平比較結(jié)果見表1。各組受試者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平總體上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ患者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組患者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組及宮頸癌組患者宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組及宮頸癌組患者宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平呈逐漸降低趨勢(shì)，IL-4、IL-6、IL-10水平呈逐漸升高趨勢(shì)。其中CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者宮頸灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各宮頸病變組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各宮頸病變組患者宮頸灌洗液中IL-2、IL-10水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組TNF-α/IL-10比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CIN Ⅲ組宮頸癌組患者TNF-α/IL-10比值顯著小于對(duì)照組、CIN I組、CIN Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌組患者TNF-α/IL-10比值小于CIN Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組受試者宮頸分泌物中 HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中細(xì)胞因子水平比較

組別nIL-2/(ng·L-1)IFN-γ/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-4/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)HR-HPV DNAIFN-γ/TNF-α對(duì)照組4016.30±2.375.16±0.268.07±0.147.57±1.327.61±2.597.27±2.09-1.26±0.73CIN Ⅰ組7138.42±11.7a12.79±1.62a 14.77±3.65a 9.24±1.43a 20.61±6.59a 13.04±2.03a 5.35±0.981.29±0.34CIN Ⅱ組6625.77±8.06ab9.35±1.38ab14.02±1.71ab15.75±3.05ab27.55±3.86ab17.47±4.12ab5.66±0.48b1.18±0.31CIN Ⅲ組7721.87±6.22abc9.14±1.34ab10.83±1.80ab16.18±2.77ab28.58±6.45ab33.00±8.71abc5.83±0.67b0.82±0.21abc宮頸癌組12519.38±5.05abcd5.86±0.81abcd9.23±1.94abcd23.48±2.25abcd49.47±15.55abcd69.60±25.15abcd6.21±1.10abcd0.41±0.83abcdF82.640472.22090.220547.61146.031209.82115.151117.770P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與CINⅠ組比較bP<0.05；與CINⅡ組比較cP<0.05；與CIN Ⅲ組比較dP<0.05；“-”無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2 HR-HPV DNA載量與6種細(xì)胞因子的關(guān)系結(jié)果見表2。多元線性回歸分析顯示，IL-2、IL-4與HR-HPV DNA載量無(wú)線性關(guān)系(P>0.05)，未進(jìn)入回歸方程；IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α與HR-HPV DNA載量存在線性關(guān)系(P<0.05)，HR-HPV DNA=6.852-0.010IL-6+0.008IL-10-0.036 TNF-α-0.066 IFN-γ，與HR-HPV載量的密切程度依次為IL-10>IL-6>IFN-γ>TNF-α。

表2 HR-HPV DNA裁量與6種細(xì)胞因子的關(guān)系分析

Tab.2 Multivariate linear regression analysis of the relationship between the HR-HPV load and six cytokines

非標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)B 標(biāo)準(zhǔn)誤差 標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)tP常量6.8520.44314.9760.000IL-100.0080.0020.299 3.9980.000IL-6-0.0100.004-0.251-1.7430.000IFN-γ-0.0660.032-0.211-1.6010.011TNF-α-0.036 0.019-0.167-1.8640.048

3 討論

從HPV感染到CIN再到宮頸癌是感染至慢性炎癥再到癌變的過(guò)程，因此，宮頸癌是一種與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的腫瘤。免疫應(yīng)答和免疫逃逸在炎癥向癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-α具有免疫保護(hù)作用，在病毒清除和癌性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10可破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重干擾機(jī)體的抗腫瘤免疫[9]。Th1和Th2細(xì)胞因子可以相互下調(diào)對(duì)方的生長(zhǎng)、分化，刺激自身增殖。Th1/Th2平衡是促炎和抗炎因子之間的平衡，也是促瘤和抗瘤作用因子的平衡。隨著微環(huán)境的變化，Th1與Th2數(shù)量發(fā)生改變，二者比例失衡，由此產(chǎn)生不同的功能效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，CINⅠ階段即有細(xì)胞因子的異常表達(dá)，Th1和Th2型細(xì)胞因子均高于對(duì)照組，以Th1型細(xì)胞因子中的IL-2、IFN-γ為著，TNF-α/IL-10比值無(wú)明顯變化，提示Th1/Th2相對(duì)平衡；CIN Ⅱ階段較CINⅠ階段明顯變化的細(xì)胞因子是IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6，有Th1優(yōu)勢(shì)表達(dá)的趨勢(shì)，TNF-α/IL-10比值略下降，Th1/Th2基本平衡；CIN Ⅲ階段TNF-α/IL-10比值急劇下降，Th1/Th2明顯失衡，呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)表達(dá)模式，直至宮頸癌變階段。這些變化提示HR-HPV感染干擾了Th1/Th2的平衡表達(dá)，由 CIN Ⅰ→CIN Ⅱ→CIN Ⅲ→宮頸癌，Th1向Th2的總體偏移趨勢(shì)參與影響宿主對(duì)病毒正確的免疫識(shí)別，從而促進(jìn)宮頸病變的持續(xù)發(fā)展。

在病變的不同階段，免疫系統(tǒng)的作用和表現(xiàn)是不同的，呈現(xiàn)階段依賴性的變化模式：CIN低度病變時(shí)，即有各種細(xì)胞因子異常表達(dá)； CIN中度病變時(shí)，各種細(xì)胞因子的調(diào)控作用此消彼長(zhǎng)，雖有單個(gè)細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-6表達(dá)的突出變化，但整個(gè)Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)仍能維持基本平衡。Th2細(xì)胞因子模式的轉(zhuǎn)變?cè)贑IN Ⅲ級(jí)病變中較為明顯，CIN Ⅲ級(jí)至宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Th2細(xì)胞因子的負(fù)向免疫抑制作用明顯高于Th1細(xì)胞因子的正向免疫保護(hù)作用。這一方面體現(xiàn)了機(jī)體免疫調(diào)控的精細(xì)化，機(jī)體可通過(guò)自我調(diào)節(jié)限制應(yīng)答的強(qiáng)度，維護(hù)過(guò)度激活、異常表達(dá)和有效免疫效應(yīng)之間的平衡，維護(hù)促癌/抗癌、促炎/抗炎微環(huán)境之間的平衡。另一方面反映了機(jī)體免疫調(diào)控的復(fù)雜性，免疫細(xì)胞之間，外來(lái)抗原HPV和免疫細(xì)胞之間，HPV、免疫細(xì)胞與局部微環(huán)境之間均存在相互制約、相互調(diào)節(jié)的交互作用和交聯(lián)影響。因此，在監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)免疫系統(tǒng)在HPV宮頸病變進(jìn)程中的作用時(shí)，不僅要考慮Th細(xì)胞因子數(shù)量的變化，更要注重Th1與Th2的比例關(guān)系，免疫反應(yīng)活躍即有細(xì)胞因子數(shù)量的變化，但Th1/Th2細(xì)胞因子比例失衡，Th2優(yōu)勢(shì)表達(dá)的免疫功能失調(diào)，可使宮頸微環(huán)境免疫抑制加重，進(jìn)一步干擾機(jī)體對(duì)HPV復(fù)制的免疫控制，使得病毒大量復(fù)制，導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染日漸嚴(yán)重，從而打破了機(jī)體微環(huán)境抗癌/促癌的內(nèi)在平衡，進(jìn)一步加劇了從CIN到宮頸癌的順向發(fā)展。由此可見，免疫抑制在HPV宮頸病變由量變到質(zhì)變整個(gè)鏈條中的重要作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道宮頸癌的免疫狀態(tài)為免疫耐受或免疫逃逸一致[10]。

有研究報(bào)道，血清細(xì)胞因子水平與HPV感染的清除或持續(xù)無(wú)關(guān)[11]，這與本研究結(jié)果不同但并不矛盾，主要原因?yàn)槟[瘤在演進(jìn)的過(guò)程中，各階段的HPV載量和細(xì)胞因子均與其周圍環(huán)境交互作用，由此形成的免疫微環(huán)境是有別于人體正常內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜系統(tǒng)，HPV感染局限于皮膚黏膜表皮細(xì)胞層，不形成病毒血癥，局部黏膜免疫系統(tǒng)具有獨(dú)特的區(qū)域免疫特性。CD4+T細(xì)胞既能在沒有CD8+T細(xì)胞的情況下，獨(dú)立將腫瘤細(xì)胞清除，還能輔助CD8+T細(xì)胞激活，并通過(guò)表達(dá)趨化因子重塑腫瘤微環(huán)境[12]，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中處于中心地位，在宮頸病變HPV感染以外的部位T細(xì)胞不直接接觸抗原，無(wú)法啟動(dòng)免疫識(shí)別機(jī)制，無(wú)相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生。

目前，關(guān)于HR-HPV病毒載量與宮頸病變程度的關(guān)系尚存在一定的爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為，HR-HPV載量與宮頸病變程度相關(guān)[13]，也有相反的報(bào)道[14]。本研究結(jié)果顯示，在CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者HR-HPV DNA載量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該2組患者HR-HPV DNA載量高于CIN Ⅰ組，低于宮頸癌組，這些均證實(shí)了HR-HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要而非充分條件，需要免疫體系協(xié)同作用。但有證據(jù)表明，慢性炎癥可通過(guò)誘導(dǎo)促炎介質(zhì)和免疫抑制細(xì)胞的積聚或激活而誘導(dǎo)或加重免疫抑制[15]，因此，對(duì)HR-HPV持續(xù)感染者仍應(yīng)堅(jiān)持隨訪，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HR-HPV DNA載量。