郝小聰，徐 磊，汪德州，房兆峰，柳 珊，孫 瑞，王偉偉，趙昌平，高世慶，唐益苗

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心，北京 100097)

類成束阿拉伯半乳糖蛋白編碼基因Fasciclin-LikeArabinogalactan-protein(FLA)普遍存在于植物、動(dòng)物和細(xì)菌中[1]。目前，已有大量關(guān)于FLA基因參與植物逆境脅迫反應(yīng)的報(bào)道[2]，如在鹽脅迫下，擬南芥FLA4的Fasciclin結(jié)構(gòu)域突變導(dǎo)致根膨脹，說(shuō)明該蛋白在鹽脅迫逆境條件下具有細(xì)胞擴(kuò)增功能[3]。FLA基因在植物花藥發(fā)育中也發(fā)揮重要作用[4]，擬南芥FLA3在花粉粒和花粉管中特異性表達(dá)，其蛋白質(zhì)與質(zhì)膜緊密結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞膜質(zhì)沉積參與小孢子發(fā)育，從而影響花粉粒的形成。fla3缺失突變體植株表現(xiàn)出花粉晚熟，且花粉粒發(fā)育異常和育性降低，F(xiàn)LA3的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致雄性花絲伸長(zhǎng)缺陷和花粉育性降低，最終降低種子的結(jié)實(shí)率[5]。在水稻中，發(fā)現(xiàn)了一種FLA糖蛋白MTR1，其控制水稻花粉細(xì)胞及周圍營(yíng)養(yǎng)層細(xì)胞的共同發(fā)育[6]。MTR1含有兩個(gè)Fasciclin結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)N糖基化位點(diǎn)和一個(gè)細(xì)胞膜定位的分泌性的N端信號(hào)肽。MTR1在花藥中特異性表達(dá)，它的缺失突變體在營(yíng)養(yǎng)層細(xì)胞絨氈層和小孢子的發(fā)育上都出現(xiàn)了缺陷，導(dǎo)致完全雄性不育。然而，大多數(shù)植物FLA蛋白的生物學(xué)功能尚不清楚[7]。小麥作為主要糧食作物之一，目前已經(jīng)利用EST序列信息報(bào)道了34個(gè)與小麥FLAs蛋白相關(guān)的基因，并發(fā)現(xiàn)了一些組織特異性表達(dá)和受到逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的FLAs基因，如TaFLA9在根部特異性表達(dá)，TaFLA4受到干旱誘導(dǎo)時(shí)上調(diào)表達(dá)[8]。但FLAs在小麥雄性不育中發(fā)揮的作用仍未見報(bào)道。

雜種優(yōu)勢(shì)利用被認(rèn)為是今后大幅度提高小麥產(chǎn)量的主要途徑之一。目前，在水稻、玉米、棉花和油菜等作物中，已在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用，但小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用仍處于初級(jí)階段[9]。小麥溫敏雄性不育系是高溫表現(xiàn)可育，低溫表現(xiàn)不育，可以通過(guò)溫度調(diào)節(jié)生產(chǎn)雜交種。目前利用小麥溫敏雄性不育系已經(jīng)培育出京麥6號(hào)、京麥7號(hào)和京麥8號(hào)等雜交小麥品種。然而，關(guān)于小麥溫敏核不育系敗育的分子機(jī)理尚不清楚。本研究根據(jù)水稻已發(fā)表的相關(guān)絨氈層特異性FLA蛋白不育基因MTR1的序列信息，利用同源克隆法，獲得1個(gè)新的小麥FLA基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究其組織特異性、非生物脅迫反應(yīng)及其在小麥溫敏雄性不育系表達(dá)方面的特性，為進(jìn)一步研究其響應(yīng)逆境脅迫和溫敏雄性不育的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其處理

以本實(shí)驗(yàn)室保存的溫敏雄性不育系BS366及普通六倍體小麥品種京411、小白麥為供試材料。將小白麥種子置于25 ℃的培養(yǎng)間，每天16 h的光照水培培養(yǎng)，生長(zhǎng)14 d后進(jìn)行高鹽(250 mmol·L-1NaCl)、低溫(4 ℃)、干旱(濾紙吸干水，空氣中晾干)、脫落酸(200 mol·L-1ABA)脅迫處理，分別在處理0 h、2 h、5 h、8 h、12 h、24 h時(shí)取各幼苗整株，液氮冷凍，保存于 -80 ℃超低溫冰箱，用于目的基因的脅迫表達(dá)分析。

取北京海淀區(qū)田間種植的開花15 d后小白麥的根、莖、葉、花藥減數(shù)分裂前期小花(除雄蕊)，液氮冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于目的基因的組織特異性表達(dá)分析。

取北京(高溫)和河南鄧州(低溫)田間種植的溫敏雄性不育系BS366和可育品種京411，待挑旗以后，分別取減數(shù)分裂前期、二分體時(shí)期、四分體時(shí)期和小孢子期的雄蕊，取材參照Tang等[10]的方法，液氮冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于分析目的基因在不育環(huán)境下和可育環(huán)境下雄蕊的表達(dá)特性。

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Trizol法提取小麥不同組織器官及幼苗的總RNA[11]，測(cè)定OD260/280值，同時(shí)利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，置于 -80 ℃超低溫冰箱備用。經(jīng)DNase I(Promega，美國(guó))處理后作為模板，以O(shè)ligo dT為引物，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥Fasciclin蛋白編碼基因的克隆

根據(jù)水稻上已發(fā)表的相關(guān)絨氈層特異性FLA蛋白不育基因MTR1(Os02g0491300)，用Gramene(http://gramene.org/)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行生物序列同源性檢索，選取相似度達(dá)63.29%的序列TraesCS5B02G045400。設(shè)計(jì)引物TaFLA-F/TaFLA-R(表1)，以BS366和京411的小孢子時(shí)期雄蕊cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系20 μL，包括2×Trans TaqHigh Fidelity PCR SuperMix(Transgen，北京)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板DNA(100 ng·L-1)1 μL、ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段經(jīng)膠回收純化并連接到pEASY-T1(Transgen，北京)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，經(jīng)菌落PCR鑒定后，每個(gè)樣品選取3個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行測(cè)序(北京六合華大基因公司)。

表1 引物名稱及序列

1.4 TaFLA蛋白的生物信息學(xué)分析

利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)預(yù)測(cè)TaFLA蛋白結(jié)構(gòu)；從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關(guān)于基因的cDNA序列和染色體位置的信息[12]。

將TaFLA的蛋白序列作為目標(biāo)序列，在Gramene(WWW.gramene.org/)網(wǎng)站搜索，獲得粗山羊草(Aegilopstauschii)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、大麥(Hordeumvulgare)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)的同源蛋白序列，并對(duì)以上蛋白序列在Pfam(http://pfam.xfam.org/)中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。對(duì)于系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進(jìn)行多序列比對(duì)分析(參數(shù)使用網(wǎng)站默認(rèn)參數(shù))，輸出序列比對(duì)結(jié)果，在MEGA 6.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用鄰接法和泊松校正模型，其中bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù)。

1.5 TaFLA基因的表達(dá)分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)網(wǎng)站對(duì)小麥TaFLA基因的表達(dá)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，根據(jù)TaFLA基因cDNA序列，避開保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)表達(dá)分析引物TaFLA-qPCR-F/TaFLA-qPCR-R(表1)。以小麥Actin為內(nèi)參對(duì)照，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2×TB Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、cDNA模板 1 μL(100 ng)，其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增于Bio-Rad qPCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；后增加熔解曲線環(huán)節(jié)，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s，通過(guò)擴(kuò)增曲線和熔解曲線確定引物特異性。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，并采用2-△△Ct法[13]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaFLA基因克隆及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

以BS366/京411小孢子時(shí)期雄蕊的cDNA為模板，利用引物TaFLA-F/TaFLA-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，得到大小為1 800 bp左右的單一條帶(圖1)。將目的片段純化、克隆并測(cè)序后，經(jīng)Blast比對(duì)分析，該基因與水稻MTR1(Os02g0491300)相似，暫命名為TaFLA(TraesCS5B02G045400)。通過(guò)比較基因組區(qū)域(http://www.gramene.org)和全長(zhǎng)cDNA序列確定Fasciclin蛋白的基因結(jié)構(gòu)，TaFLA轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度為1 812 bp，含有1 530 bp的編碼序列，37 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)和247 bp的3’UTR。預(yù)測(cè)的TaFLA蛋白長(zhǎng)509個(gè)氨基酸并含有預(yù)測(cè)的N-末端信號(hào)肽，2個(gè)Fasciclin結(jié)構(gòu)域(氨基酸205-300、371-474)和兩個(gè)N-glycosylation sites(氨基酸369和487)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)(圖2)。利用Pfam(http://Pfam.xfam.org/)分析TaFLA基因所編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其含有FLA domain superfamily，進(jìn)一步說(shuō)明TaFLA基因?qū)儆贔LA基因家族。

M：DL2000；366：BS366擴(kuò)增產(chǎn)物；411：京411擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DL2000; 366:BS366 amplification product; 411:Jing 411 amplification product.

圖1TaFLA凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1 Amplicons ofTaFLAseparated by electrophoresis

2.2 TaFLA同源蛋白序列的比對(duì)及進(jìn)化分析

為了分析TaFLA基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將其蛋白序列進(jìn)行Blastp全長(zhǎng)序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列與來(lái)源于二粒小麥(TRIDC5BG-007410)、大麥(HORVU5Hr1G010360)、粗山羊草(AET5Gv20128400)、短柄草(BRADI_3g29350v3)、水稻(Os02g0491300)的蛋白序列相似性分別為100%、99%、55%、78%、57%。所有Fasciclin蛋白均包含2個(gè)Fasciclin結(jié)構(gòu)域，且位置完全相同(圖2)。利用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明，單子葉和雙子葉植物FLA蛋白分別聚為兩類，小麥與二粒小麥親緣關(guān)系最近(圖3)。

2.3 TaFLA基因的組織特異性表達(dá)分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)網(wǎng)站查找轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)小麥TaFLA基因不同時(shí)期不同組織的表達(dá)分析表明，該基因在根、莖、葉、花、籽粒中均有表達(dá)，而在穗中的早期表達(dá)量最高，有明顯的組織特異性。將小白麥開花15 d后不同組織的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果(圖4)表明，TaFLA基因在減數(shù)分裂時(shí)期的雄蕊及其穗中高度表達(dá)，與小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)模式一致。

2.4 TaFLA基因在不同非生物脅迫下的表達(dá) 分析

為進(jìn)一步了解TaFLA基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)，以提取的不同脅迫處理下小白麥幼苗的cDNA 作為模板，利用熒光定量PCR技術(shù)，分析在低溫、高鹽、干旱和ABA處理下小麥幼苗中該基因的表達(dá)情況。結(jié)果(表2)表明，該基因?qū)Φ蜏孛{迫敏感，表達(dá)量先持續(xù)下降，到8 h時(shí)驟然上升至處理前的2.4倍，達(dá)到最高值，隨后表達(dá)水平下降，表明TaFLA表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)；在干旱脅迫處理下，該基因表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到最低值，大約為處理前表達(dá)量的10%，其余時(shí)期表達(dá)量基本維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平；高鹽處理2 h后，該基因表達(dá)量急劇下降至最低；ABA處理下表達(dá)量均有所下降，24 h達(dá)到最低值。以上結(jié)果表明，TaFLA基因在低溫誘導(dǎo)下強(qiáng)烈表達(dá)，而在干旱，高鹽和ABA誘導(dǎo)下表達(dá)受到抑制。

2.5 TaFLA基因在小麥溫敏雄性不育系BS366雄蕊中的表達(dá)分析

小麥溫敏雄性不育系BS366種植于北京(高溫)表現(xiàn)花粉可育，種植于河南鄧州(低溫)表現(xiàn)出花粉敗育。為了進(jìn)一步明確TaFLA基因在小麥溫敏雄性不育中的調(diào)控機(jī)制，以小麥溫敏雄性不育系BS366和普通小麥品種京411(對(duì)照)為實(shí)驗(yàn)材料，利用熒光定量PCR技術(shù)，分析TaFLA基因在可育和不育環(huán)境下雄蕊中的表達(dá)特性(圖5)，結(jié)果表明，在溫敏雄性不育系BS366中該基因在不育環(huán)境下(10 ℃)二分體時(shí)期雄蕊中高度表達(dá)，約為可育環(huán)境下 (20 ℃)二分體時(shí)期的雄蕊中表達(dá)量的29倍，但在京411中該基因表達(dá)量變化不大，說(shuō)明TaFLA基因可能參與小麥溫敏雄性不育調(diào)控反應(yīng)。

1.黑色方框代表TaFLA與其他9種植物序列包含的Fasciclin結(jié)構(gòu)域；2.黑色橢圓框代表TaFLA序列中包含的兩個(gè)N-glycosylation sites位點(diǎn)。

1.The black box represents the Fasciclin domain contained in TaFLA and the nine sequences in other plants; 2.The black oval box represents the two N-glycosylation sites in the TaFLA sequence.

圖2 TaFLA蛋白與其他9種植物FLA蛋白序列的比對(duì)

Fig.2 Comparison of TaFLA protein and the nine FLA protein sequences in other plants

鄰接法構(gòu)建的進(jìn)化樹，表示TaFLA與其他9種植物FLA系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

The phylogenetic tree was constructed by the adjacency method,representing the evolution analysis of TaFLA and the nine FLA proteins in other plants.

圖3 TaFLA系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.3 Phylogenetic analysis of FLA proteins

1：根；2：莖；3：葉；4：小穗(除去雄蕊)；5：減數(shù)分裂時(shí)期的雄蕊；6：穎殼；7：葉鞘。

1:Root; 2:Stem; 3:Leaf; 4:Spikelet(removal of stamen); 5:Stamen at meiosis; 6:Glume; 7:Leaf sheath.

圖4 小麥TaFLA基因在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量

Fig.4 Relative expression ofTaFLAgene in different organs in wheat

3 討 論

Fasciclin蛋白在植物中廣泛存在，且在擬南芥、水稻等植物中均有報(bào)道[14]，但小麥作為世界最重要的糧食作物之一，目前基于小麥EST序列信息只有34個(gè)小麥FLA蛋白基因被報(bào)道。隨著小麥基因組測(cè)序工作完成，將有更多的FLA蛋白基因被克隆，并進(jìn)行功能鑒定。本研究基于水稻雄性不育基因MTR1基因序列，在小麥中同源克隆了該基因，考慮小麥中有A,B,D三個(gè)亞基因，TaFLA可能存在來(lái)自不同A,B,D三個(gè)亞基因組的同源基因，在Gramene(www.gramene.org/)中，僅發(fā)現(xiàn)了TaFLA-B和TaFLA-D，設(shè)計(jì)不同引物進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，但僅克隆出B亞基因組中TaFLA-B，并命名為TaFLA，目前尚未見該基因在小麥中有研究報(bào)道。序列比對(duì)結(jié)果表明，TaFLA基因所編碼的氨基酸序列與水稻、擬南芥等植物Fasciclin氨基酸序列同源性高，且含有2個(gè)FLA保守結(jié)構(gòu)域[15]，屬于Fasciclin蛋白 家族。

表2 小麥TaFLA基因在不同脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量

10 ℃的MMC、Dyad、Tetrad、MP分別表示在不育環(huán)境下的減數(shù)分裂前期、二分體期、四分體期和小孢子期；20 ℃的MMC、Dyad、Tetrad、MP分別表示在可育環(huán)境下的減數(shù)分裂前期、二分體期、四分體期和小孢子期。

MMC,Dyad,Tetrad and MP at 10 ℃ indicate pre-meiosis,bipartite,tetrad and microspores in infertile environment,respectively; MMC,Dyad,Tetrad and MP at 20 ℃,represent pre-meiosis,bipartite,tetrad and microspores in fertile environment,respectively.

圖5 小麥TaFLA基因在可育和不可育環(huán)境下的抽穗期四個(gè)階段的相對(duì)表達(dá)量

Fig.5 Relative expression ofTaFLAgene in wheat at four stages of heading stage in fertile and infertile environments

TaFLA具有兩個(gè)預(yù)測(cè)的Fasciclin結(jié)構(gòu)域[16]，與擬南芥序列相比，序列具有很大的差異，但與水稻相似性極高，說(shuō)明單子葉和雙子葉植物的FLA家族可能在單子葉植物和雙子葉植物進(jìn)化之前就開始分化了。FLA家族是擬南芥中發(fā)現(xiàn)的主要類型的Fasciclin蛋白。FLA可能因?yàn)槠淙狈GP的保守序列，影響植物細(xì)胞壁的形成，從而在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。水稻MTR1是花藥絨氈層細(xì)胞和花粉形成的必需基因。使用遺傳互補(bǔ)和生化分析，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)膜定位、N-糖基化以及兩個(gè)Fasciclin結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛TR1在花藥發(fā)育和花粉成熟中的作用是不可或缺的。水稻MTR1基因的mtr1突變體表現(xiàn)出花藥發(fā)育缺陷和繁殖力降低[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaFLA在小穗和減數(shù)分裂時(shí)期的雄蕊中表達(dá)量均高于其他組織，表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，且在二分體期雄蕊中表達(dá)量最高，推測(cè)該基因可能在小麥雄蕊發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。

小麥溫敏雄性不育系BS366在高溫表現(xiàn)為雄性可育，低溫表現(xiàn)為雄性不育的特性。唐忠輝[9]等報(bào)道小麥溫敏雄性不育系BS366在10 ℃生長(zhǎng)條件下(即不育環(huán)境)，其雄蕊細(xì)胞質(zhì)分裂異常，不能形成正常的二分體；在20 ℃生長(zhǎng)條件下(即可育環(huán)境)雄蕊細(xì)胞質(zhì)分裂正常，形成二分體。研究結(jié)果表明，TaFLA基因與水稻中控制花粉育性MTR1高度同源[18]，在低溫誘導(dǎo)下大量表達(dá)，且在小麥花藥中高度表達(dá)，TaFLA基因在溫敏雄性不育系BS366不育環(huán)境下的雄蕊中，在二分體時(shí)期表達(dá)達(dá)到最高，比可育環(huán)境下相應(yīng)時(shí)期的表達(dá)量有極顯著的提高。而該基因在可育系京411的二分體時(shí)期，低溫處理環(huán)境(10 ℃)和正常生長(zhǎng)環(huán)境(20 ℃)差異不大，說(shuō)明TaFLA可能參與小麥溫敏雄性不育信號(hào)網(wǎng)絡(luò)途徑。

TaFLA在小麥正常發(fā)育的雄蕊中表現(xiàn)為特異性表達(dá)，該基因可能是小麥花藥正常發(fā)育的必要基因，缺失TaFLA可能導(dǎo)致小麥花粉育性下降，其功能可能與水稻MTR1類似；而過(guò)量表達(dá)也同樣可能引起植物的雄性不育，如本研究中發(fā)現(xiàn)TaFLA在小麥溫敏雄性不育系中不育環(huán)境下(10 ℃)的大量表達(dá)，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。據(jù)此推測(cè)，精確適量表達(dá)TaFLA才能確保小麥花藥的正常的發(fā)育，這可能是導(dǎo)致小麥溫敏雄性不育花粉敗育的主要原因，上述推斷為研究小麥溫敏雄性不育和花藥發(fā)育提供了新的思路和方法。