昌 西，裴 悅，胡 凡，任苗苗，王 彤，聶小軍

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

RNA編輯(RNA editing)是指DNA在轉(zhuǎn)錄形成mRNA過(guò)程中，由于核苷酸的插入、缺失或替換而使得原有的遺傳信息發(fā)生改變的生物學(xué)現(xiàn)象[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，RNA編輯是一種常見(jiàn)的RNA水平修飾，是增加基因轉(zhuǎn)錄和功能多樣性的重要形式，一個(gè)基因序列通過(guò)編輯修飾，可以合成多個(gè)不同的蛋白質(zhì)，從而參與控制不同的性狀或者生物學(xué)過(guò)程[2-3]。自1986年，RNA編輯現(xiàn)象首次在錐蟲(chóng)的線粒體中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[4]，人們圍繞RNA編輯已經(jīng)開(kāi)展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)RNA編輯現(xiàn)象廣泛存在于各種生物體中，包括動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌，表明RNA編輯可能是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種保守的遺傳信息擴(kuò)展機(jī)制[5-8]。據(jù)報(bào)道，真核生物大約35%的基因存在基因編輯現(xiàn)象，不僅細(xì)胞核中三類(lèi)RNA編碼基因(mRNA、tRNA和rRNA)存在RNA編輯現(xiàn)象，細(xì)胞器(包括線粒體和葉綠體)基因組也存在大量的RNA編輯現(xiàn)象，并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯效率及時(shí)序特異性表達(dá)等方面發(fā)揮了重要作用[9-10]，如玉米葉綠體基因rpl2，其起始密碼子為ACG，必須發(fā)生C到T的編輯才能形成正確的起始密碼子ATG，起始轉(zhuǎn)錄和翻譯[11]。

葉綠體是植物細(xì)胞所特有的細(xì)胞器，是植物光合作用的主要器官，其具有自身的基因組并半自主地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，在很多生理生化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[12-13]。因此，對(duì)植物葉綠體基因組中的RNA編輯進(jìn)行系統(tǒng)分析和研究不僅有利于探究RNA編輯發(fā)生的分子機(jī)制和進(jìn)化意義，也有利于解析葉綠體RNA編輯參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的生物學(xué)功能。1991，Hoch等[11]首次在植物葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了RNA編輯現(xiàn)象。隨后，研究者們對(duì)陸生植物葉綠體RNA編輯開(kāi)展了大量研究工作，尤其是對(duì)ndhB基因研究較為深入[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，在高等被子植物中，ndhB基因存在約15個(gè)編輯位點(diǎn)，但低等植物中其編輯位點(diǎn)顯著減少，比如在松葉蕨類(lèi)植物中只有1個(gè)位點(diǎn)，在地錢(qián)類(lèi)植物中僅有2個(gè)位點(diǎn)，在蕨類(lèi)植物中有4個(gè)位點(diǎn)。在被子植物葉綠體基因組中，通常具有約30個(gè)編輯位點(diǎn)[16-17]，Corneille等[18]在水稻葉綠體中發(fā)現(xiàn)了21個(gè)編輯位點(diǎn)，在玉米葉綠體中發(fā)了26個(gè)編輯位點(diǎn)，其中18個(gè)位點(diǎn)為兩者共有；Kerstin等[19]利用RT-PCR技術(shù)對(duì)黑麥葉綠體的編輯位點(diǎn)進(jìn)行了分析，共從33個(gè)轉(zhuǎn)錄本中鑒定發(fā)現(xiàn)31個(gè)編輯位點(diǎn)，其中5個(gè)是黑麥特有的；鄧?yán)罾さ萚20]通過(guò)對(duì)小麥返白系葉綠體RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了分布于14個(gè)基因的28個(gè)位點(diǎn)。

青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudum Hoork.f.)又稱(chēng)裸大麥，是青藏高原一種重要的傳統(tǒng)糧食作物，具有悠久的栽培歷史[21-22]。其在分類(lèi)學(xué)上屬于禾本科大麥屬，是大麥的一種特殊類(lèi)型，因其脫粒時(shí)內(nèi)外穎和穎果容易分離，籽粒為裸露，故稱(chēng)裸大麥。青稞作為青藏高原的特色作物，現(xiàn)已成為藏區(qū)種植業(yè)、糧食生產(chǎn)與加工領(lǐng)域中占有支柱地位的主要作物[23]。青稞不僅是藏民族的主要糧食，同時(shí)也是釀造(青稞酒)的原料及牲畜的飼料，由于其籽粒蘊(yùn)含豐富的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、賴(lài)氨酸和β-葡聚糖，青稞逐漸成為新興保健食品的主要原料[24]。與其他禾本科作物相比，青稞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿和耐瘠薄等優(yōu)良特性。因此，青稞不僅為藏區(qū)人民的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了非常大的貢獻(xiàn)，而且為作物抗逆遺傳改良提供了重要的基因庫(kù)[25]。目前，青稞全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為開(kāi)展青稞基因組學(xué)研究提供了必要的序列資源和信息，推動(dòng)青稞基礎(chǔ)研究進(jìn)入到組學(xué)時(shí)代[26]。同時(shí)，青稞的葉綠體基因組也已測(cè)定[27]，為鑒定青稞葉綠體基因組RNA編輯位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。鑒于目前有關(guān)青稞葉綠體RNA編輯的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)青稞葉綠體基因組中的RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后結(jié)合RT-PCR技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，最后將青稞與栽培大麥、野生大麥及其他麥類(lèi)作物葉綠體RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行比較，以期從RNA編輯視角揭示青稞的起源和進(jìn)化關(guān)系，為研究青稞葉綠體RNA編輯的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步揭示RNA編輯的作用機(jī)制提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以青稞主栽品種藏青2000為試驗(yàn)材料。將其室內(nèi)發(fā)芽后，正常培養(yǎng)至三葉期，采集幼嫩葉片，并保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 青稞及栽培大麥、野生大麥葉綠體基因組RNA編輯位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載青稞的葉綠體基因組序列(序列號(hào)為KT962228.1)，根據(jù)注釋信息，提取其蛋白質(zhì)編碼基因并去冗余，得到76個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因；然后將這些序列提交到Prep-Cp數(shù)據(jù)庫(kù)[28]，對(duì)其RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)下載栽培大麥(EF115541.1)和野生大麥(KC912689.1)的葉綠體基因組序列，提取所有蛋白質(zhì)編碼序列并去除冗余后，也采用同樣方法進(jìn)行RNA編輯位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。

1.2.2 青稞DNA及總RNA的提取

取0.2 g葉片，在液氮中研磨成精細(xì)粉末，采用改良的CTAB法[29]提取樣品的DNA；采用TRizol法(Life technology,USA)提取樣品的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 青稞總RNA的純化及cDNA的合成

將提取的RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ(TaKaRa，大連)37 ℃處理30 min，去除其中可能存在的DNA污染，然后加入等體積的酚/氯仿(苯酚∶氯仿=25∶24)抽提，獲得純化后的總RNA，并取 1 μL用于cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行(TaKaRa，大連)，具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。最后，將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 青稞葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證

為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)到的編輯位點(diǎn)準(zhǔn)確性，將所有預(yù)測(cè)的分布于15個(gè)基因的編輯位點(diǎn)進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)編輯位點(diǎn)上下游序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為20 μL，包括10 μL 2×Mix，8 μL ddH2O，1 μL上述步驟得到的cDNA，目標(biāo)基因上下游引物各0.5 μL。PCR程序?yàn)?94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。同時(shí)以青稞DNA為模板，采用同樣引物和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用純化回收試劑盒(天根，北京)回收后直接進(jìn)行雙向測(cè)序(生工，上海)。用Seqman 11.2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，用 BioEdit 7.2.6工具比對(duì)每個(gè)基因的DNA和cDNA序列，最后手工校對(duì)和分析其中的RNA編輯位點(diǎn)。

表1 RT-PCR和PCR擴(kuò)增所用引物序列信息

1.2.5 RNA編輯對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響

選取驗(yàn)證后發(fā)生編輯的葉綠體基因，將其編輯前后的蛋白序列分別采用在線工具TMHMM Server V.2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html)對(duì)其蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和比較，初步分析RNA編輯對(duì)其編碼蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.6 禾本科作物葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)間的比較

將預(yù)測(cè)獲得的青稞葉綠體RNA編輯位點(diǎn)，與已報(bào)道的小麥[20]、野生二粒小麥[30]、粗山羊草[31]、黑麥[19]、大麥[3]、玉米[32]、水稻[18]、甘蔗[33]等禾木科作物的葉綠體編輯位點(diǎn)進(jìn)行比較，分析麥類(lèi)及其他禾本科作物葉綠體編輯位點(diǎn)的異同，鑒定保守位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與 鑒定

將從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的青稞76個(gè)非冗余葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼基因遞交到Prep-Cp數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行RNA編輯位點(diǎn)的預(yù)測(cè)(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在青稞葉綠體基因組中共預(yù)測(cè)到35個(gè)編輯位點(diǎn)，所有的編輯位點(diǎn)均發(fā)生了從C到U的變化；在76個(gè)蛋白編碼基因中，發(fā)生RNA編輯的有15個(gè)基因；所有的編輯均引起了氨基酸的變化，氨基酸轉(zhuǎn)變類(lèi)型有7種，分別為H→Y、L→F、P→S、P→L、S→F、S→L、T→M，其中S→L和P→L兩種轉(zhuǎn)變形式出現(xiàn)次數(shù)最多，這與其他禾本科葉綠體基因組RNA編輯的組成特征相似[30-31]。在發(fā)生編輯的所有基因中，ndhB的編輯位點(diǎn)數(shù)最多，達(dá)9個(gè)；之后依次是rpoC2，有5個(gè)位點(diǎn)；rpoB和ndhA分別有4個(gè)位點(diǎn)，ndhF和rpoB分別有2個(gè)位點(diǎn)，其余的基因均為1個(gè)編輯位點(diǎn)(表2)。對(duì)編輯發(fā)生的密碼子位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這些編輯位點(diǎn)中有4個(gè)發(fā)生于于密碼子的第一位，剩余的31個(gè)均位于密碼子的第二位，在密碼子第三位沒(méi)有編輯現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2 青稞葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所預(yù)測(cè)的編輯位點(diǎn)是否為真實(shí)發(fā)生的編輯，采用PCR和RT-PCR方法對(duì)所預(yù)測(cè)的35個(gè)位于15個(gè)基因的青稞葉綠體RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行了擴(kuò)增及測(cè)序(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的10個(gè)基因中的18個(gè)位點(diǎn)DNA和cDNA堿基不一致，被證實(shí)確實(shí)發(fā)生了RNA水平的序列改變，即RNA編輯(圖2)。所有這18個(gè)被驗(yàn)證的位點(diǎn)均被前期生物信息分析方法所預(yù)測(cè)到，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的未被預(yù)測(cè)到的編輯位點(diǎn)(表2)，表明保守位點(diǎn)的生物信息預(yù)測(cè)的結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。其中ndhB基因預(yù)測(cè)的9個(gè)編輯位點(diǎn)均證實(shí)為真實(shí)存在的編輯位點(diǎn)(表2)，暗示RNA編輯對(duì)nhdB基因生物學(xué)功能的正常發(fā)揮可能具有重要的調(diào)控作用。

M:DL2000; 1～6分別是基因ndhF、petB、rpl2、rpl20、rpoA和ycf3的擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DL2000 marker; 1-6 indicate PCR products ofndhF,petB,rpl2,rpl20,rpoAandycf3,respectively.

圖1 部分基因的RT-PCR電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis of the PT-PCR proclucts of 6 chloroplast genes in hulless barley

2.3 RNA編輯對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響效應(yīng)分析

為了明確RNA編輯對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，我們進(jìn)一步對(duì)未編輯和編輯后其所編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，在所有可能發(fā)生RNA編輯的基因中，基因ndhD、rpl2、atpA、atpB發(fā)生編輯后的α螺旋減少；而基因petB、rps8、ndhA的α螺旋則相對(duì)增多；其中基因rpl2和atpB的無(wú)規(guī)卷曲數(shù)在發(fā)生編輯后有所減少，其他5個(gè)基因的無(wú)規(guī)卷曲數(shù)量均有增加；另外，基因rpl2、petB、rps8的延伸鏈數(shù)量在RNA編輯后有所增加，其余4個(gè)基因的延伸鏈數(shù)量減少(圖3)。以上預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明，RNA編輯的發(fā)生會(huì)影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此在編輯發(fā)生后，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，可能導(dǎo)致相應(yīng)的生理生化反應(yīng)發(fā)生變化從而最終影響基因生物學(xué)功能的表達(dá)。對(duì)基因跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，基因ndhA與ndhB在RNA編輯發(fā)生后，均發(fā)生了較顯著的變化，即分別多出了3處和1處跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4)。

表2 青稞葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

Y表示實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的編輯位點(diǎn)；N表示實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證未發(fā)生編輯的位點(diǎn)。

Y represents the validated RNA editing sites by RT-PCR while N represents the non-validated site.

圖2 青稞ndhB和ndhD基因的序列比對(duì)及RNA編輯位點(diǎn)的鑒定

A,B,C,D,E,F,G分別為編輯前的ndhD,rpl2,atpA,atpB,petB,rps8和ndhA基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); a,b,c,d,e,f,g分別為編輯后的ndhD,rpl2,atpA,atpB,petB,rps8和ndhA基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

A to G indicate secondary structures of coding proteins before editing ofndhD,rpl2,atpA,atpB,petB,rps8andndhArespectively; a to g indicates secondary structures of coding proteins after editing ofndhD,rpl2,atpA,atpB,petB,rps8andndhA,respectively.

圖3 RNA編輯對(duì)基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

Fig.3 Predicted secondary structures of seven proteins encoded by seven edited genes

2.4 青稞與其他禾本科物種葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)間的比較

比較分析青稞與栽培大麥以及野生大麥的RNA編輯位點(diǎn)的異同，發(fā)現(xiàn)青稞與栽培大麥的RNA編輯位點(diǎn)分布和組成完全一致，均有分布于15個(gè)基因中的35個(gè)編輯位點(diǎn)，而野生大麥只有34個(gè)RNA編輯位點(diǎn)；相比于栽培大麥和青稞，野生大麥中缺少了ndhA-563編輯位點(diǎn)(表3)。結(jié)合前人研究結(jié)果，比較青稞與其他七個(gè)禾本科物種的葉綠體RNA編輯位點(diǎn)的異同，發(fā)現(xiàn)在這8個(gè)物種中有atpA-1、ndhA-2、ndhB-2等13個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了完全編輯，暗示這些位點(diǎn)在禾本科物種進(jìn)化中具有較高的保守性；而ndhK-1只在黑麥中發(fā)生了編輯，其他7個(gè)物種中均未發(fā)生編輯，表明其為黑麥所特異的編輯位點(diǎn)(表3)。

3 討 論

作為一種非常重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控方式，RNA編輯極大地豐富了生物體的遺傳信息。在高等植物中，RNA編輯主要在葉綠體等細(xì)胞器基因組中發(fā)生。大量研究發(fā)現(xiàn)，RNA編輯在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等生理生化過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)和鑒定RNA編輯位點(diǎn)是開(kāi)展RNA編輯生物學(xué)功能相關(guān)研究的前提。本研究首先利用生物信息學(xué)方法，采用Prep-Cp數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到了青稞葉綠體基因組中可能發(fā)生了RNA編輯的位點(diǎn)，然后基于預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)分子克隆方法對(duì)這些預(yù)測(cè)的編輯位點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，青稞葉綠體基因組的76個(gè)蛋白編碼基因中，有15個(gè)發(fā)生了RNA編輯，共包含35處編輯位點(diǎn)，而其中18個(gè)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，暗示生物信息學(xué)預(yù)測(cè)雖然為RNA編輯的發(fā)掘與鑒定提供了一個(gè)高效、簡(jiǎn)便的方法，但對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[30-31]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有編輯位點(diǎn)均為胞嘧啶到尿嘧啶的變換，而且編輯位點(diǎn)主要發(fā)生于密碼子第二位堿基，第一位堿基變換頻率次之，而第三位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編輯位點(diǎn)，這與前人對(duì)禾本科植物葉綠體RNA編輯組成特征分析的結(jié)果相一致[34]。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，RNA編輯的發(fā)生會(huì)造成相應(yīng)的氨基酸發(fā)生改變；最常見(jiàn)的改變是從絲氨酸(Ser,S)到亮氨酸(Leu,L)的轉(zhuǎn)變，這與早前高等植物的葉綠體RNA編輯的特征一致[35-36]。同時(shí)，這也表明由RNA編輯所導(dǎo)致的基因個(gè)體間翻譯的蛋白質(zhì)可能存在差異，從而使得基因組具有了遺傳多樣性。RNA編輯引起相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由此或?qū)⒃斐傻鞍坠δ馨l(fā)生變化，而蛋白質(zhì)功能的變化如何影響或調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育，還有待我們更深入的研究。

圖4 RNA編輯對(duì)基因ndhA和ndhB編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的影響

表3 青稞與野生大麥、栽培大麥及其他7種禾本科植物葉綠體基因RNA編輯位點(diǎn)的比較

編輯位點(diǎn)列中大寫(xiě)字母代表該堿基發(fā)生了編輯；+表示完全編輯；-表示未發(fā)生編輯，DNA序列中為C；(-)表示未發(fā)生編輯，DNA序列中為T(mén)；+a表示部分編輯；空格表示編輯情況未知。

Capital letters in editing site indicate edited bases；+ indicates complete editing；- indicates no editing and C encoded in DNA；(-)indicates no editing and T encoded in DNA；+a indicates partial editing；Blank indicates unknown editing.