沈梓力 李美芹 邱甜 吳燕燕 吳月燕 謝曉鴻
摘要:通過性狀的統(tǒng)計分析和開發(fā)的SSR多態(tài)位點(diǎn)的統(tǒng)計分析,篩選以粉紅泡泡(母本)和白鶴(父本)雜交育種產(chǎn)生的F1代的優(yōu)良新品種,以期作為今后開發(fā)推廣的一種新型種質(zhì)資源。采用表型分析結(jié)合SSR分子標(biāo)記分析的方式,對杜鵑親本及F1代的49份種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)評價和分類分析。表型性狀結(jié)果表明,花色的變異系數(shù)最大,為54%;葉片絨毛變異系數(shù)最小,為25%。表型性狀聚類分析結(jié)果表明,親本及F1代聚為7個類群,第1類包含2個個體,第2類包含2個個體,第3類包含4個個體,第4類包含17個個體,第5類包含4個個體,第6類包含9個個體,第7類包含13個個體。分子聚類結(jié)果表明,親本及F1代共聚成6個類群,第1類包含13個個體,第2類包含7個個體,第3類包含7個個體,第4類包含8個個體,第5類包含15個個體,第6類包含1個個體。據(jù)SSR標(biāo)記的聚類與表型性狀聚類具有一定的相關(guān)性但并不完全一致。
關(guān)鍵詞:杜鵑花;表型性狀;SSR標(biāo)記;種質(zhì)資源
中圖分類號: S685.210.24文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號:1002-1302(2019)18-0177-05
收稿日期:2018-05-27
基金項目:浙江省寧波市重大科技專項(編號:2014C11002);浙江省“生物工程”重中之重學(xué)科學(xué)生創(chuàng)新計劃(編號:CX2017012)。
作者簡介:沈梓力(1993—),男,浙江溫州人,碩士研究生,研究方向為食品化學(xué)工程與安全控制。E-mail:747643963@qq.com。
通信作者:謝曉鴻,碩士,高級農(nóng)藝師,研究方向為觀賞植物應(yīng)用研究。E-mail:285300628@qq.com。
杜鵑花(Rhododendron simsii L.)屬杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron),是我國十大名花之一。我國是杜鵑花的起源地之一,具有豐富的種質(zhì)資源,但是我國新種質(zhì)資源的開發(fā)起步較晚,造成我國種質(zhì)資源相對匱乏的局面[1]。目前,多利用雜交育種的方式選育優(yōu)良植株,這類植株具有觀賞性高的特點(diǎn),但難以確?;虻亩鄻有裕赡軙M(jìn)一步的育種工作造成影響。因此,利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)篩選優(yōu)良新種質(zhì)是杜鵑花選育的有效途徑。表型多樣性的研究主要是通過科學(xué)有效地采樣、合理有效的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法[2],根據(jù)形態(tài)性狀、生理生化性狀等變異較穩(wěn)定的性狀,揭示群體的遺傳規(guī)律和變異大小,客觀評價其遺傳多樣性。目前,許多學(xué)者利用表型性狀研究生物多樣性,在甜瓜(Cucumis melo L.)[3]、大蒜(Allium sativum L.)[4]、菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)[5]、水稻(Oryza sativa)[6]、獼猴桃(Actinidia spp.)[7]、孔雀草(Tagetes patula L.)[8]、板栗(Castanea mollissima Bl.)[9]等植物中得到了應(yīng)用。基因多樣性鑒定多依據(jù)植株基因組的重要作用位點(diǎn)的多樣性進(jìn)行鑒定,確定植株基因的多樣性。
簡單重復(fù)序列(simple sequence sepeat,簡稱SSR)即微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),是廣泛存在于真核和原核生物基因組中1~6個核苷酸基元串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[10],是基于PCR技術(shù)建立起來的第2代分子標(biāo)記技術(shù),該標(biāo)記主要根據(jù)生物中SSR位點(diǎn)的多寡來判斷不同生物個體的基因多樣性,從而判斷物種的多樣性及豐富性,具有多態(tài)性高、共顯性、通用性高、可靠性且重復(fù)性高等特點(diǎn)[11],常用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的檢測、基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇等。
目前,有學(xué)者利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)研究生物遺傳多樣性,在五節(jié)芒(Miscanthus floridulus)[12]、棉屬(Gossypium Lin.)[13]、紫薇(Lagerstroemia indica)[14]、杜鵑(Rhododendron L.)[15-16]等植物中均有報道,但利用表型性狀結(jié)合SSR標(biāo)記創(chuàng)制雜交F1代杜鵑花種質(zhì)資源的研究尚未見報道。開展杜鵑花種質(zhì)資源創(chuàng)制,對于杜鵑花優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、保存、評價和利用具有重要意義。因此,本研究以白鶴和粉紅泡泡雜交F1代為基礎(chǔ),結(jié)合形態(tài)標(biāo)記和SSR分析,開展了杜鵑花種質(zhì)資源的創(chuàng)制研究,旨在為杜鵑花的新種質(zhì)創(chuàng)制、生產(chǎn)應(yīng)用以及杜鵑花種質(zhì)資源的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
1?材料與方法
1.1?試驗材料
試驗?zāi)副景Q與父本粉紅泡泡于2011年4月進(jìn)行雜交,2016年9月進(jìn)行試驗,田間試驗基地為浙江省寧波市北侖萬景杜鵑良種園,從獲得的100株F1代中隨機(jī)抽取49株作為試驗材料。
1.2?試驗方法
1.2.1?表型性狀的選取與編碼
收集親本及F1代49株植株的葉片并編號掛牌,對表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計。以杜鵑花數(shù)量分類[17]與杜鵑花品種資源和構(gòu)建分類體系的調(diào)查研究[18]為基礎(chǔ)。選取園藝植物的10個性狀進(jìn)行統(tǒng)計(表1),主要分為株型、分枝特性、枝條顏色、葉片顏色、絨毛特性、葉緣、花冠類型、花冠形狀、花色以及花緣進(jìn)行性狀統(tǒng)計和測量。
1.2.2?基因組DNA提取
采用改良CTAB法[19]提取基因組DNA,采用BIO-RAD Smart Spec Plus核酸純度儀和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性和純度,根據(jù)檢測結(jié)果將可用DNA樣品稀釋至50 ng/μL,保存于-20 ℃冰箱中備用。
1.2.3?SSR分析
選用本試驗開發(fā)的10對多態(tài)性SSR引物對親本及F1代49份材料的基因型進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)總體系為10 μL,包括1 μL 1×Buffer(含Mg+)、0.8 μL0.2 mmol/L dNTPs、1 μL 0.25 mmol/L上下游引物、0.1 μL0.5 U DNA polymerase以及0.5 μL 50 ng/μL DNA模板,加6.6 μL ddH2O補(bǔ)齊體系。反應(yīng)在Eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercycler普通梯度PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測,EB染色,紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad Gel Doc XR+)成像觀察。
1.3?數(shù)據(jù)處理與分析
對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理后,遺傳距離利用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化后表示;統(tǒng)計整理SSR位點(diǎn)信息,利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類分析方法計算并建立表型及基因分類樹狀圖[20]。
2?結(jié)果與分析
2.1?主要性狀分析
由表2可知,雜交后代出現(xiàn)了一定程度的遺傳變異,個體間也出現(xiàn)了明顯的性狀差異。其株型、枝條、葉片、花等均出現(xiàn)一定比例的性狀分化,49株子代植株中,質(zhì)量性狀中植株株型的變異系數(shù)為30%;枝條分枝特性變異系數(shù)為35%,顏色變異系數(shù)為34%;葉片顏色變異系數(shù)為35%, 絨毛變異系數(shù)為25%,葉緣變異系數(shù)為50%;花的變異系數(shù)相對較大,花冠類型變異系數(shù)為53%,花冠形狀變異系數(shù)為41%,花色變異系數(shù)為54%,花緣變異系數(shù)為35%。
2.2?杜鵑花F1代表型性狀相關(guān)性分析
基于遺傳相似系數(shù)矩陣,用SPSS 19.0軟件對親本和49份材料進(jìn)行聚類分析,獲得10個性狀的聚類圖。由圖1可知,F(xiàn)1代表型性狀主要聚為7個類群,第1類包含2個個體,分別為粉紅泡泡和87;第2類包含2個個體,分別為白鶴和6;第3類包含4個個體,分別為白鶴36、64、49和51;第4類包含17個個體,分別為70、79、75、55、65、58、38、63、66、71、25、91、27、19、48、69和86;第5類包含4個個體,分別是21、32、14和31;第6類包含9個個體,分別是46、89、20、44、16、34、15、7和90;第7類包含13個個體,分別是10、50、24、5、52、18、9、22、40、11、35、17和26。在第1類中,87號植株與粉紅泡泡聚為一類;第2類中,6號個體與白鶴聚為一類;第3類中,64號植株花為玫紅色,與其他3個個體存在很大差異,但是在株型上有很大的相似性;第4類中的17個個體中,種質(zhì)分類最為混亂,發(fā)生花色變異的植株大多聚在這一類,表明該聚類種質(zhì)性狀復(fù)雜,極有可能發(fā)生一定程度的變異,因此可以作為新種質(zhì)資源選育的分類點(diǎn);第5類中,花型和花色均有一定程度的變異,可作為候選新種質(zhì)的類別;第6類聚類中,植株從屬性和花色屬性上都與母本白鶴相似,發(fā)生了極少量的變異,因此不宜作為新種質(zhì)的開發(fā)類別;第7類中花屬性發(fā)生了變異,可作為候選新種質(zhì)的類別。
2.3?SSR標(biāo)記的多態(tài)性
利用試驗開發(fā)的10個標(biāo)記對49個后代及親本進(jìn)行多態(tài)性篩選,共擴(kuò)增出23條多態(tài)性條帶,多態(tài)性條帶數(shù)為2~4個(表3)。
2.4?雜交F1代聚類分析
通過UPGMA進(jìn)行聚類分析表明,親本和F1代49份種質(zhì)共聚成6個類群,第1類包含13個個體,分別為63、64、66、86、5、9、11、87、粉紅泡泡、24、32、46和48;第2類包含7個個體,分別為34、71、19、7、31、14和75;第3類包含7個個體,分別為58、69、10、27、50、44和65;第4類包含8個個體,分別為9、白鶴、16、35、51、22、40和70;第5類包含15個個體,分別為79、89、26、21、18、25、38、52、90、15、17、20、36、49和91;第6類包含1個個體,為55號(圖2)。
以質(zhì)量性狀為基礎(chǔ),結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類結(jié)果和SSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果,選取觀賞價值高且遺傳多樣性高的品種作為候選種質(zhì)。55號種質(zhì)花冠類型為單瓣,花冠形狀為碟型,花色為粉色,花緣為波狀,綜合了親本的生物學(xué)性狀且出現(xiàn)了一定程度的變異,基于Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類結(jié)果顯示55號種質(zhì)聚到第4類,基于SSR分子標(biāo)記的聚類聚到第6類,表明55號雜交種質(zhì)具有較高的性狀差異和遺傳差異。64號雜交種質(zhì)花冠類型為重瓣,花冠形狀為碟型,花色為玫紅色,花緣為波狀,在花冠類型和花色方面出現(xiàn)了一定程度的變異,基于Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類聚到第3類,與親本白鶴聚為一類,基于SSR分子標(biāo)記的聚類聚到第1類,與親本粉紅泡泡聚為一類,表明64號雜交種質(zhì)是親本植株的雜交種質(zhì),變異系數(shù)相對較小,但觀賞性狀相對較高。因此,具有較高的觀賞性狀和一定遺傳差異的55號和64號雜交種適合作為候選新品種。經(jīng)過表現(xiàn)型的觀察和對比親本表現(xiàn)型與F1代49份種質(zhì),發(fā)現(xiàn)55號(圖3)、64號新種質(zhì)(圖4)。這2種新種質(zhì)的性狀穩(wěn)定且遺傳性優(yōu)良,因此可以將這2種新種質(zhì)從中挑選出來,作為新品種進(jìn)行推廣。
3?討論與結(jié)論
目前,許多學(xué)者利用表型性狀的改變來衡量植株變異[21-24],但是表型變異需要長期的積累過程才能逐步形成,難以及時反饋生物的變異信息,且是基因和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。因此,利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記對生物變異進(jìn)行統(tǒng)計分析,是衡量生物變異及基因多樣性的一個重要手段[25]。分子標(biāo)記聚類具有更高的靈敏度。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究杜鵑花種質(zhì)的遺傳多樣性,可以不受環(huán)境、發(fā)育時期和器官等的限制,從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度,且在早期就可進(jìn)行新品種的鑒定[26]。
在杜鵑花實際生產(chǎn)過程中,優(yōu)良種質(zhì)資源大多根據(jù)表型性狀進(jìn)行篩選,在生產(chǎn)過程中會造成選育失敗以及種質(zhì)的性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象。在實際生產(chǎn)過程中,利用更為科學(xué)的手段進(jìn)行種質(zhì)資源的選育成為解決新種質(zhì)選育所面臨問題的關(guān)鍵。因此,利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合表型性狀的差異進(jìn)行選育是相對更為科學(xué)的選育體系。這為杜鵑花的選育工作提供了更為科學(xué)的依據(jù)。
本研究對F1代49份種質(zhì)以及親本的10個表型性狀的聚類分析研究表明,供試材料的表型性狀相似程度高的樣本聚為一類,通過此表型聚類結(jié)果可知,利用Person相關(guān)系數(shù)進(jìn)行表型聚類具有極高的應(yīng)用價值。表型聚類結(jié)合分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果表明,兩者聚類結(jié)果不完全一致,具有一定的差異。這可能是因為所選SSR位點(diǎn)的覆蓋率以及SSR位點(diǎn)的作用位點(diǎn)的不同而具有一定的差異。但是通過表型聚類結(jié)合分子聚類對生物變異進(jìn)行分析,具有更高的應(yīng)用價值以及現(xiàn)實意義。
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