沈梓力 李美芹 邱甜 吳燕燕 吳月燕 謝曉鴻

摘要：通過性狀的統(tǒng)計分析和開發(fā)的SSR多態(tài)位點(diǎn)的統(tǒng)計分析，篩選以粉紅泡泡（母本）和白鶴（父本）雜交育種產(chǎn)生的F1代的優(yōu)良新品種，以期作為今后開發(fā)推廣的一種新型種質(zhì)資源。采用表型分析結(jié)合SSR分子標(biāo)記分析的方式，對杜鵑親本及F1代的49份種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)評價和分類分析。表型性狀結(jié)果表明，花色的變異系數(shù)最大，為54%;葉片絨毛變異系數(shù)最小，為25%。表型性狀聚類分析結(jié)果表明，親本及F1代聚為7個類群，第1類包含2個個體，第2類包含2個個體，第3類包含4個個體，第4類包含17個個體，第5類包含4個個體，第6類包含9個個體，第7類包含13個個體。分子聚類結(jié)果表明，親本及F1代共聚成6個類群，第1類包含13個個體，第2類包含7個個體，第3類包含7個個體，第4類包含8個個體，第5類包含15個個體，第6類包含1個個體。據(jù)SSR標(biāo)記的聚類與表型性狀聚類具有一定的相關(guān)性但并不完全一致。

關(guān)鍵詞：杜鵑花;表型性狀;SSR標(biāo)記;種質(zhì)資源

中圖分類號： S685.210.24文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0177-05

收稿日期：2018-05-27

基金項目：浙江省寧波市重大科技專項（編號：2014C11002）;浙江省“生物工程”重中之重學(xué)科學(xué)生創(chuàng)新計劃（編號：CX2017012）。

作者簡介：沈梓力（1993—），男，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)工程與安全控制。E-mail：747643963@qq.com。

通信作者：謝曉鴻，碩士，高級農(nóng)藝師，研究方向為觀賞植物應(yīng)用研究。E-mail：285300628@qq.com。

杜鵑花（Rhododendron simsii L.）屬杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron），是我國十大名花之一。我國是杜鵑花的起源地之一，具有豐富的種質(zhì)資源，但是我國新種質(zhì)資源的開發(fā)起步較晚，造成我國種質(zhì)資源相對匱乏的局面[1]。目前，多利用雜交育種的方式選育優(yōu)良植株，這類植株具有觀賞性高的特點(diǎn)，但難以確?；虻亩鄻有裕赡軙M(jìn)一步的育種工作造成影響。因此，利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)篩選優(yōu)良新種質(zhì)是杜鵑花選育的有效途徑。表型多樣性的研究主要是通過科學(xué)有效地采樣、合理有效的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法[2]，根據(jù)形態(tài)性狀、生理生化性狀等變異較穩(wěn)定的性狀，揭示群體的遺傳規(guī)律和變異大小，客觀評價其遺傳多樣性。目前，許多學(xué)者利用表型性狀研究生物多樣性，在甜瓜（Cucumis melo L.）[3]、大蒜（Allium sativum L.）[4]、菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）[5]、水稻（Oryza sativa）[6]、獼猴桃（Actinidia spp.）[7]、孔雀草（Tagetes patula L.）[8]、板栗（Castanea mollissima Bl.）[9]等植物中得到了應(yīng)用。基因多樣性鑒定多依據(jù)植株基因組的重要作用位點(diǎn)的多樣性進(jìn)行鑒定，確定植株基因的多樣性。

簡單重復(fù)序列（simple sequence sepeat，簡稱SSR）即微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），是廣泛存在于真核和原核生物基因組中1～6個核苷酸基元串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[10]，是基于PCR技術(shù)建立起來的第2代分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記主要根據(jù)生物中SSR位點(diǎn)的多寡來判斷不同生物個體的基因多樣性，從而判斷物種的多樣性及豐富性，具有多態(tài)性高、共顯性、通用性高、可靠性且重復(fù)性高等特點(diǎn)[11]，常用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的檢測、基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇等。

目前，有學(xué)者利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)研究生物遺傳多樣性，在五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）[12]、棉屬（Gossypium Lin.）[13]、紫薇（Lagerstroemia indica）[14]、杜鵑（Rhododendron L.）[15-16]等植物中均有報道，但利用表型性狀結(jié)合SSR標(biāo)記創(chuàng)制雜交F1代杜鵑花種質(zhì)資源的研究尚未見報道。開展杜鵑花種質(zhì)資源創(chuàng)制，對于杜鵑花優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、保存、評價和利用具有重要意義。因此，本研究以白鶴和粉紅泡泡雜交F1代為基礎(chǔ)，結(jié)合形態(tài)標(biāo)記和SSR分析，開展了杜鵑花種質(zhì)資源的創(chuàng)制研究，旨在為杜鵑花的新種質(zhì)創(chuàng)制、生產(chǎn)應(yīng)用以及杜鵑花種質(zhì)資源的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

試驗?zāi)副景Q與父本粉紅泡泡于2011年4月進(jìn)行雜交，2016年9月進(jìn)行試驗，田間試驗基地為浙江省寧波市北侖萬景杜鵑良種園，從獲得的100株F1代中隨機(jī)抽取49株作為試驗材料。

1.2?試驗方法

1.2.1?表型性狀的選取與編碼

收集親本及F1代49株植株的葉片并編號掛牌，對表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計。以杜鵑花數(shù)量分類[17]與杜鵑花品種資源和構(gòu)建分類體系的調(diào)查研究[18]為基礎(chǔ)。選取園藝植物的10個性狀進(jìn)行統(tǒng)計（表1），主要分為株型、分枝特性、枝條顏色、葉片顏色、絨毛特性、葉緣、花冠類型、花冠形狀、花色以及花緣進(jìn)行性狀統(tǒng)計和測量。

1.2.2?基因組DNA提取

采用改良CTAB法[19]提取基因組DNA，采用BIO-RAD Smart Spec Plus核酸純度儀和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性和純度，根據(jù)檢測結(jié)果將可用DNA樣品稀釋至50 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3?SSR分析

選用本試驗開發(fā)的10對多態(tài)性SSR引物對親本及F1代49份材料的基因型進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)總體系為10 μL，包括1 μL 1×Buffer（含Mg+）、0.8 μL0.2 mmol/L dNTPs、1 μL 0.25 mmol/L上下游引物、0.1 μL0.5 U DNA polymerase以及0.5 μL 50 ng/μL DNA模板，加6.6 μL ddH2O補(bǔ)齊體系。反應(yīng)在Eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercycler普通梯度PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測，EB染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad Gel Doc XR+）成像觀察。

1.3?數(shù)據(jù)處理與分析

對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理后，遺傳距離利用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化后表示;統(tǒng)計整理SSR位點(diǎn)信息，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類分析方法計算并建立表型及基因分類樹狀圖[20]。

2?結(jié)果與分析

2.1?主要性狀分析

由表2可知，雜交后代出現(xiàn)了一定程度的遺傳變異，個體間也出現(xiàn)了明顯的性狀差異。其株型、枝條、葉片、花等均出現(xiàn)一定比例的性狀分化，49株子代植株中，質(zhì)量性狀中植株株型的變異系數(shù)為30%;枝條分枝特性變異系數(shù)為35%，顏色變異系數(shù)為34%;葉片顏色變異系數(shù)為35%， 絨毛變異系數(shù)為25%，葉緣變異系數(shù)為50%;花的變異系數(shù)相對較大，花冠類型變異系數(shù)為53%，花冠形狀變異系數(shù)為41%，花色變異系數(shù)為54%，花緣變異系數(shù)為35%。

2.2?杜鵑花F1代表型性狀相關(guān)性分析

基于遺傳相似系數(shù)矩陣，用SPSS 19.0軟件對親本和49份材料進(jìn)行聚類分析，獲得10個性狀的聚類圖。由圖1可知，F(xiàn)1代表型性狀主要聚為7個類群，第1類包含2個個體，分別為粉紅泡泡和87;第2類包含2個個體，分別為白鶴和6;第3類包含4個個體，分別為白鶴36、64、49和51;第4類包含17個個體，分別為70、79、75、55、65、58、38、63、66、71、25、91、27、19、48、69和86;第5類包含4個個體，分別是21、32、14和31;第6類包含9個個體，分別是46、89、20、44、16、34、15、7和90;第7類包含13個個體，分別是10、50、24、5、52、18、9、22、40、11、35、17和26。在第1類中，87號植株與粉紅泡泡聚為一類;第2類中，6號個體與白鶴聚為一類;第3類中，64號植株花為玫紅色，與其他3個個體存在很大差異，但是在株型上有很大的相似性;第4類中的17個個體中，種質(zhì)分類最為混亂，發(fā)生花色變異的植株大多聚在這一類，表明該聚類種質(zhì)性狀復(fù)雜，極有可能發(fā)生一定程度的變異，因此可以作為新種質(zhì)資源選育的分類點(diǎn);第5類中，花型和花色均有一定程度的變異，可作為候選新種質(zhì)的類別;第6類聚類中，植株從屬性和花色屬性上都與母本白鶴相似，發(fā)生了極少量的變異，因此不宜作為新種質(zhì)的開發(fā)類別;第7類中花屬性發(fā)生了變異，可作為候選新種質(zhì)的類別。

2.3?SSR標(biāo)記的多態(tài)性

利用試驗開發(fā)的10個標(biāo)記對49個后代及親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，共擴(kuò)增出23條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為2～4個（表3）。

2.4?雜交F1代聚類分析

通過UPGMA進(jìn)行聚類分析表明，親本和F1代49份種質(zhì)共聚成6個類群，第1類包含13個個體，分別為63、64、66、86、5、9、11、87、粉紅泡泡、24、32、46和48;第2類包含7個個體，分別為34、71、19、7、31、14和75;第3類包含7個個體，分別為58、69、10、27、50、44和65;第4類包含8個個體，分別為9、白鶴、16、35、51、22、40和70;第5類包含15個個體，分別為79、89、26、21、18、25、38、52、90、15、17、20、36、49和91;第6類包含1個個體，為55號（圖2）。

以質(zhì)量性狀為基礎(chǔ)，結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類結(jié)果和SSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果，選取觀賞價值高且遺傳多樣性高的品種作為候選種質(zhì)。55號種質(zhì)花冠類型為單瓣，花冠形狀為碟型，花色為粉色，花緣為波狀，綜合了親本的生物學(xué)性狀且出現(xiàn)了一定程度的變異，基于Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類結(jié)果顯示55號種質(zhì)聚到第4類，基于SSR分子標(biāo)記的聚類聚到第6類，表明55號雜交種質(zhì)具有較高的性狀差異和遺傳差異。64號雜交種質(zhì)花冠類型為重瓣，花冠形狀為碟型，花色為玫紅色，花緣為波狀，在花冠類型和花色方面出現(xiàn)了一定程度的變異，基于Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類聚到第3類，與親本白鶴聚為一類，基于SSR分子標(biāo)記的聚類聚到第1類，與親本粉紅泡泡聚為一類，表明64號雜交種質(zhì)是親本植株的雜交種質(zhì)，變異系數(shù)相對較小，但觀賞性狀相對較高。因此，具有較高的觀賞性狀和一定遺傳差異的55號和64號雜交種適合作為候選新品種。經(jīng)過表現(xiàn)型的觀察和對比親本表現(xiàn)型與F1代49份種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)55號（圖3）、64號新種質(zhì)（圖4）。這2種新種質(zhì)的性狀穩(wěn)定且遺傳性優(yōu)良，因此可以將這2種新種質(zhì)從中挑選出來，作為新品種進(jìn)行推廣。

3?討論與結(jié)論

目前，許多學(xué)者利用表型性狀的改變來衡量植株變異[21-24]，但是表型變異需要長期的積累過程才能逐步形成，難以及時反饋生物的變異信息，且是基因和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。因此，利用表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記對生物變異進(jìn)行統(tǒng)計分析，是衡量生物變異及基因多樣性的一個重要手段[25]。分子標(biāo)記聚類具有更高的靈敏度。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究杜鵑花種質(zhì)的遺傳多樣性，可以不受環(huán)境、發(fā)育時期和器官等的限制，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，且在早期就可進(jìn)行新品種的鑒定[26]。

在杜鵑花實際生產(chǎn)過程中，優(yōu)良種質(zhì)資源大多根據(jù)表型性狀進(jìn)行篩選，在生產(chǎn)過程中會造成選育失敗以及種質(zhì)的性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象。在實際生產(chǎn)過程中，利用更為科學(xué)的手段進(jìn)行種質(zhì)資源的選育成為解決新種質(zhì)選育所面臨問題的關(guān)鍵。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合表型性狀的差異進(jìn)行選育是相對更為科學(xué)的選育體系。這為杜鵑花的選育工作提供了更為科學(xué)的依據(jù)。

本研究對F1代49份種質(zhì)以及親本的10個表型性狀的聚類分析研究表明，供試材料的表型性狀相似程度高的樣本聚為一類，通過此表型聚類結(jié)果可知，利用Person相關(guān)系數(shù)進(jìn)行表型聚類具有極高的應(yīng)用價值。表型聚類結(jié)合分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果表明，兩者聚類結(jié)果不完全一致，具有一定的差異。這可能是因為所選SSR位點(diǎn)的覆蓋率以及SSR位點(diǎn)的作用位點(diǎn)的不同而具有一定的差異。但是通過表型聚類結(jié)合分子聚類對生物變異進(jìn)行分析，具有更高的應(yīng)用價值以及現(xiàn)實意義。

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