王華華 張楊陽 劉文文

摘要：在酸性（pH值<5）土壤中，鋁毒害是制約農作物生產的主要逆境因子。鋁毒通過抑制根系生長，影響作物對水分和營養(yǎng)物質的吸收，最終導致農作物產量下降。以大豆為試驗材料，探討鋁脅迫下外源一氧化氮（NO）對鋁毒害的調節(jié)作用。結果顯示，不同鋁濃度處理可抑制大豆根的生長及根尖伸長區(qū)細胞的伸長，且可誘發(fā)根尖丙二醛（MDA）和H2O2含量的升高;進一步研究結果顯示，NO處理可顯著緩解鋁抑制的根生長及根尖伸長區(qū)細胞的伸長，且降低根尖MDA、H2O2含量，提升根尖抗氧化酶活性。表明NO可能通過提高根尖抗氧化能力來緩解鋁脅迫對根尖伸長區(qū)細胞伸長的抑制，從而改善根系的生長。

關鍵詞：大豆;根系生長;一氧化氮;信號分子;鋁毒害;耐受性;生長抑制;緩解作用;抗性品種篩選

中圖分類號： Q945.78;S565.101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0122-03

收稿日期：2018-06-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：U1704121）;河南師范大學優(yōu)秀青年科學基金（編號：14YQ003）;河南師范大學博士啟動課題（編號：11129）。

作者簡介：王華華（1980—），男，湖北孝感人，博士，副教授，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素。通常情況下，鋁以不溶性硅酸鹽或氧化物的形式存在。當土壤發(fā)生酸化（pH值<5）時，鋁會以有毒Al3+的狀態(tài)釋放進土壤溶液中，對植物產生毒害[1]。鋁毒最明顯的特征是抑制植物根尖生長，影響植物對水分及營養(yǎng)物質的吸收，從而導致植物生長受到抑制及農作物減產。然而，目前關于鋁對根生長的抑制機制還不太清楚。

正常情況下，生物體內活性氧的生成和清除處于動態(tài)平衡，當活性氧濃度超過正常水平時，即對細胞構成氧化脅迫。鋁毒可引起植物體內活性氧的過量積累，從而導致植物細胞遭受氧化傷害。為了減輕和防止活性氧損傷，植物體形成了相應的氧化應激機制。目前研究得比較清楚的是細胞可通過抗氧化酶，如過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等清除過量的活性氧并抑制脂質過氧化，從而避免細胞遭受氧化傷害[2]。

一氧化氮（NO）作為一種重要的信號分子，參與植物生長發(fā)育和脅迫反應的調節(jié)[3]。研究表明，NO在種子萌發(fā)、根伸長、植物衰老、程序性細胞死亡和氣孔運動中發(fā)揮著重要的作用[4]。此外，NO也可在非生物脅迫中對植物發(fā)揮保護作用，且該作用與NO介導的活性氧含量減少密切相關[5-6]。然而，關于NO在鋁脅迫誘導的大豆根生長抑制中的調節(jié)作用及其機制還不太清楚。本研究通過NO供體硝普鈉（SNP）處理大豆幼苗，探討鋁脅迫下外源NO對鋁毒的調節(jié)作用，以期為進一步揭示大豆抗鋁毒信號網絡途徑及篩選和培育抗鋁毒品種提供幫助。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試大豆種子由甘肅省農業(yè)科學院提供。

1.2?材料培養(yǎng)

選取大小一致的大豆種子，用清水浸泡后均勻放置在充分吸水的海綿上，并在種子表面覆蓋1層濕潤的紗布，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48 h，然后挑選根長約2 cm的大豆種子，置于1/4霍格蘭氏培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照度150 μmol/（m2·s），相對濕度70%，光—暗周期14 h—10 h。

1.3?材料處理

采用AlCl3模擬鋁脅迫處理，以硝普鈉（SNP）為外源NO供體，將生長3 d的大豆幼苗分別移入400 mL含有0（對照） μmol/L、50（50AI） μmol/L、100（100AI） μmol/L AlCl3或25 μmol/L SNP（SNP）、25 μmol/L SNP+50 μmol/L AlCl3（50Al+SNP）、25 μmol/L SNP+100 μmol/L AlCl3（100Al+SNP）的CaCl2溶液（0.5 mmol/L，pH值為4.5）中處理24 h。處理后收集主根用于各項指標的測定。

1.4?測定方法

根伸長量的測定：選取生長3 d、長勢相似的大豆幼苗，測量其處理前根長，處理后再次對根長進行測量，根伸長量為2次根長的差值;根伸長區(qū)細胞的觀察：取長約2 cm的大豆根尖，用蒸餾水沖洗后，置于卡諾氏固定液中在4 ℃下固定24 h，將固定好的根尖置于1 mol/L鹽酸溶液中解離10～15 min，用蒸餾水沖洗后壓片觀察;根尖丙二醛（MDA）、H2O2含量的測定參照Liu等的方法[7];POD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定參照Wang等的方法[8]。所測指標均至少重復3次，取平均值。

2?結果與分析

2.1?鋁脅迫對大豆根伸長和伸長區(qū)細胞伸長的影響

根伸長的受抑制程度是反映植物受鋁毒害程度的重要指標。為了檢測大豆對鋁脅迫的敏感性，本研究檢測不同鋁濃度對根生長的影響，結果（圖1）發(fā)現，隨著AlCl3濃度的升高，大豆根伸長量逐漸降低。具體表現為與對照相比，50、100 μmol/L AlCl3處理的根伸長量分別降低24%、39%，且鋁脅迫不僅對大豆主根的生長造成了抑制，也影響了側根的生長和數量。

為了進一步探究鋁脅迫對大豆幼苗根生長抑制的機制，對根尖伸長區(qū)細胞的伸長量進行檢測。由圖2可知，鋁脅迫下根尖伸長區(qū)細胞的伸長量與根伸長量呈正相關關系，表現出與根伸長一致的變化趨勢。具體表現為50、100 μmol/L AlCl3處理的根尖伸長區(qū)細胞伸長量與對照相比分別減少18%、33%。說明鋁脅迫可能通過抑制根尖伸長區(qū)細胞的伸長來抑制大豆根的生長。

2.2?鋁脅迫下NO對大豆根伸長和伸長區(qū)細胞伸長的影響

由圖3可知，單獨SNP處理對大豆幼苗根伸長量無明顯影響;而50、100 μmol/L AlCl3脅迫下，SNP處理顯著緩解了根的伸長抑制，根伸長量比單獨鋁處理時分別增加18.6%、33.1%。

根尖伸長區(qū)是植物感受鋁毒害的主要區(qū)域。為了探究鋁脅迫下NO緩解根生長抑制的原因，本研究測定了鋁脅迫下NO處理后根尖伸長區(qū)細胞伸長量的變化。由圖3可知，鋁脅迫下SNP處理顯著緩解了根尖伸長區(qū)細胞的伸長抑制。具體表現為SNP+50 μmol/L AlCl3和SNP+100 μmol/L AlCl3處理分別比單獨鋁處理時細胞伸長量增加15.3%和19.2%。表明鋁脅迫下NO可通過緩解根尖伸長區(qū)細胞伸長抑制來緩解鋁毒害對根的生長抑制。

2.3?鋁脅迫下NO對根尖MDA、H2O2含量的影響

丙二醛、活性氧含量是衡量植物遭受氧化傷害程度的重要指標[9]。為了探究鋁脅迫導致的根生長抑制是否由氧化傷害造成，本研究檢測根尖MDA、H2O2含量。由圖4可知，與對照相比，50 μmol/L AlCl3處理的根尖MDA、H2O2含量分別增加29.8%、40.1%;添加SNP后，MDA、H2O2含量與單獨鋁處理相比分別降低47.6%、32.3%。隨著鋁處理濃度的升高，MDA、H2O2含量也逐漸升高，但SNP依然可以顯著降低根尖MDA、H2O2含量。說明SNP可通過緩解根尖細胞受氧化傷害的程度，改善大豆根的生長抑制情況。

2.4?鋁脅迫下NO對抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化氫酶是植物體內重要的抗氧化酶，它們能夠清除多余的活性氧，維持植物體內活性氧平衡，保護植物免受氧化傷害。為了進一步探究NO增強根尖細胞抗氧化能力的原因，本研究檢測抗氧化酶活性的變化。由圖5可知，與對照相比，鋁脅迫處理顯著增強了CAT、APX、POD的活性，SNP處理則進一步提高了這3種酶的活性。例如，50 μmol/L AlCl3脅迫下，添加SNP處理后，CAT、APX、POD的活性與單獨鋁處理相比分別增加了31.3%、39.5%、38.7%。說明NO可能通過提高CAT、APX、POD的活性來清除多余的活性氧，從而避免或降低根尖細胞受到的氧化傷害。

3?討論與結論

鋁會在植物根尖中積累，與細胞膜中磷脂結合可以導致膜的僵化，從而抑制根系的生長，導致植物生長受限和農作物減產。根伸長抑制是植物遭受鋁毒害時最初和最明顯的癥狀之一[10]。本研究結果顯示，鋁處理后，大豆根生長和根尖伸長區(qū)細胞的伸長受到了明顯的抑制，且兩者呈現出正相關性，表明鋁脅迫誘導的根生長抑制可能是由于根尖伸長區(qū)細胞的伸長受到抑制所導致的。

有研究表明，NO參與了植物受鋁脅迫時的生理反應過程，例如減輕鋁誘導的決明子幼苗根系生長抑制[1]。然而，尚不清楚NO調節(jié)鋁誘導的植物根生長抑制的機制。本研究探討鋁脅迫下NO的作用效果，結果表明，鋁脅迫下NO顯著緩解了大豆根的伸長抑制，且NO主要是通過緩解根尖伸長區(qū)細胞的伸長抑制來緩解根生長抑制。

植物在遭受鋁毒害后通常會出現氧化應激和膜脂過氧化等相關癥狀[11]。有研究報道表明，鋁誘導的毒害與植物中H2O2含量的增加有關[12]。H2O2在根中的積累可能最終導致根伸長量的降低[13]。本研究結果表明，鋁脅迫顯著增加了大豆根尖中MDA、H2O2含量，其誘發(fā)的活性氧積累可能是大豆幼苗在遭受鋁脅迫時根生長受到抑制的原因。NO供體處理降低了大豆根中鋁誘導的H2O2產生量和膜脂過氧化程度，這可能是緩解大豆根伸長受到抑制的原因。

CAT、APX、POD是植物體內抗氧化系統(tǒng)關鍵酶，它們可以通過清除細胞中多余的活性氧來緩解鋁毒害[14]。本研究中，鋁處理后大豆根尖CAT、APX、POD的活性與對照相比顯著增強，添加NO處理后，這3種酶活性進一步增強，表明NO緩解鋁誘導的氧化傷害可能是通過調控體內抗氧化酶活性清除多余的活性氧來完成的。

綜上所述，本研究發(fā)現，鋁脅迫通過誘導大豆根尖活性氧的積累，導致根尖膜脂過氧化，使得根尖伸長區(qū)細胞的伸長受到抑制，從而導致大豆根生長受到抑制。NO通過增強大豆幼苗抗氧化酶活性，清除多余的活性氧積累，減輕鋁誘導的氧化脅迫，緩解大豆根生長抑制。

參考文獻：

[1]Wang Y S，Yang Z M. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots of Cassia tora L.[J]. Plant and Cell Physiology，2005，46（12）：1915-1923.

[2]Mittler R. Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：405-410.

[3]Gupta K J，Fernie A R，Kaiser W M. On the origins of nitric oxide[J]. Trends in Plant Science，2011，16（3）：160-168.

[4]Shi H T，Wang Y P，Cheng Z M，et al. Analysis of natural variation in bermudagrass （Cynodon dactylon） reveals physiological responses underlying drought tolerance[J]. PLoS One，2012，7（12）：e53422.