吳翼 劉蕊 郭愛汕 李靜 楊耀東

摘要：應(yīng)用硅膠干燥法對(duì)棕櫚科3個(gè)不同屬作物椰子、油棕和檳榔的葉片經(jīng)干燥處理后置于不同溫度條件下保存3個(gè)月，以新鮮葉片為對(duì)照，采用簡易十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，分析硅膠干燥處理后對(duì)DNA提取效果的影響。研究結(jié)果表明，硅膠干燥法處理的葉片提取的基因組DNA質(zhì)量較好，與對(duì)照無明顯差異，完全可以應(yīng)用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。硅膠干燥法處理的葉片在常溫條件下保存即可達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求，這為今后棕櫚科植物試驗(yàn)材料的中短期保存提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞：棕櫚科植物;硅膠干燥;DNA提取;椰子;油棕;檳榔

中圖分類號(hào)： S590.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0083-03

收稿日期：2018-08-31

基金項(xiàng)目：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（編號(hào)：1630152017019、1630152017007）。

作者簡介：吳?翼（1980—），男，海南文昌人，碩士，助理研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：wuyi-scuta@163.com。

通信作者：楊耀東，博士，副研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：yyang8@qq.com。

棕櫚科植物是單子葉植物中一個(gè)非常有特色的植物類群，全世界共有200多屬3 000余種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。原產(chǎn)于美洲、澳洲的棕櫚科植物種類最多，約有100屬1 400種，少數(shù)原產(chǎn)于非洲和歐洲[1]，原產(chǎn)于我國的有18屬117種，主產(chǎn)地為云南、廣東、海南、廣西、臺(tái)灣、福建、四川、湖南、江西、貴州，西藏的一些溫暖地區(qū)也有分布[2]。

提取完整的基因組DNA是分子生物學(xué)研究的起點(diǎn)。野外采集葉片材料時(shí)往往很難及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低溫保存而使材料發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響DNA的提取效果。硅膠脫水干燥法保存植物樣品操作方便，不受時(shí)間限制，已在多種作物中應(yīng)用[3-9]，均取得較好的效果，而在棕櫚科植物上的應(yīng)用未見報(bào)道。本研究對(duì)棕櫚科植物椰子、油棕和檳榔的葉片分別采用硅膠脫水干燥后置于25 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存3個(gè)月，以新鮮葉片為對(duì)照，采用簡易十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對(duì)3種不同處理的樣品進(jìn)行基因組DNA提取效果的比較分析，探討硅膠干燥葉片對(duì)棕櫚科植物DNA提取的影響，以期為今后棕櫚科植物材料的長期保存提供新的方法。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以椰子、油棕和檳榔3種棕櫚科植物為試驗(yàn)材料，均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所種質(zhì)圃。取完全展開的新鮮葉片，用變色硅膠干燥后置于25 ℃（常溫）、-20 ℃和-80 ℃ 保存3個(gè)月后提取基因組DNA，同時(shí)以新鮮葉片為對(duì)照（CK）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?DNA的提取方法?采用CTAB法，參考吳翼等的方法[10]，具體步驟：（1）取約2 g幼葉新鮮材料或約1 g干燥材料在研缽中加液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加約5 mL提取液，搖勻，置于冰上，將所有材料研磨完后，進(jìn)行下一步操作。（2）離心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），棄去上清（小心管內(nèi)粉末）。再次加入約5 mL提取緩沖液，搖勻，離心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），小心棄去上清。（3）在管中加入5 mL 65 ℃預(yù)熱的裂解液，搖勻。65 ℃水浴90～120 min，每30 min 搖1次。（4）裂解后冷卻2 min，加等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶1）抽提液，搖勻（搖50次左右，再渦旋約2 min）至乳濁液。15 min、8 000 r/min、25 ℃離心。（5）吸取上清，轉(zhuǎn)入新的15 mL離心管，加入0.6倍體積的冰凍異丙醇和0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH值5.2），緩慢搖勻至沉淀析出。（6）將離心管離心（3 min，8 000 r/min，25 ℃）。再將沉淀轉(zhuǎn)入2 mL離心管，用70%乙醇1 mL洗滌2次。加70%乙醇1 mL浸泡過液。（7）去鹽離子及可溶于乙醇的雜質(zhì)：次日，用70%乙醇1 mL洗1次，自然風(fēng)干或者離心干燥后加0.7 mL的滅菌水溶解。（8）加等體積酚+三氯甲烷+異戊醇（體積比25 ∶24 ∶1）抽提液，冷卻2 min，搖勻（約50次后再渦旋30 s），離心（15 min，8 000 r/min，25 ℃）。（9）取上清加等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶1）抽提液，冷卻后，搖勻（約50次后再渦旋30 s），離心15 min，8 000 r/min，25 ℃。（10）吸取上清，加入2倍體積的冰凍乙醇和0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH值5.2），緩慢搖勻至沉淀析出。-20 ℃下放置1 h以上。（11）離心（3 min，8 000 r/min，25 ℃），用0.1 mL槍頭吸干，再用70%乙醇洗2次（去鹽離子）。盡可能吸干凈乙醇，自然風(fēng)干或者離心干燥至DNA略有潮濕，用TE（根據(jù)DNA多少確定用量）溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?DNA檢測方法?（1）紫外分光光度計(jì)檢測。取2 μL DNA樣品加ddH2O稀釋50倍至100 μL，用紫外分光光度計(jì)測定D230 nm、D260 nm、D280 nm以及D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值，判斷DNA的純度;再根據(jù)公式計(jì)算DNA樣品濃度，具體公式：DNA樣品濃度=D260 nm×稀釋倍數(shù)×50/1 000。（2）2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取出一定量的DNA，稀釋成100 ng/μL，取8 μL在2%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照，根據(jù)λ-DNA判斷基因組DNA的分子質(zhì)量和大小。（3）簡單重復(fù)序列（SSR）-PCR擴(kuò)增檢測。分別以所提取的DNA為模板進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。所用SSR引物Co107的序列分別為5′-CAGTAGTGCCCAAGAATAGA-3′和5′-TGCGTCACACACACACAG-3′，由Bioneer公司合成;25 mmol/L MgCl2、4×10 mmol/L dNTPs、5 U/μL Taq DNA 聚合酶、10×Taq Buffer均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR擴(kuò)增在TaKaRa-TP 600擴(kuò)增儀上進(jìn)行，其擴(kuò)增體系與擴(kuò)增程序如下：總體積為20 μL，其中10×PCR Buffer 20 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）0.5 μL，SSR引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，模板DNA（20 ng/μL）2 μL。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，25個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2?結(jié)果與分析

2.1?紫外分光光度法檢測結(jié)果

CTAB法提取的DNA沉淀呈透明膠狀，沒有酚類氧化或其他色素造成的污染。由表1、表2、表3可見，DNA溶液的D260 nm/D280 nm值大部分為1.70～1.90，D260 nm/D230 nm值在2.0左右，進(jìn)一步說明提取的DNA較純，RNA較少，多糖、蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)污染也較少。與對(duì)照組（CK）相比，硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA的D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值較接近，無明顯差異。

2.2?瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1、圖2、圖3）可以看出，3種棕櫚科植物材料提取的DNA條帶整齊、清晰、無明顯彌散現(xiàn)象，表明DNA完整性較好，降解較少。點(diǎn)樣孔亮度微弱，表明提取到的DNA純度高，蛋白質(zhì)、酚類及多糖類等雜質(zhì)去除得較徹底。由圖1和圖2可知，椰子、油棕各個(gè)處理所提取的DNA純度都較好，條帶整齊、清晰，與λDNA接近。硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA（泳道4～12）與對(duì)照組（泳道1～3）無明顯差異;圖3顯示，檳榔各個(gè)處理的DNA條帶均暗于λDNA，硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA（泳道4～12）均略有降解現(xiàn)象，相比對(duì)照組（泳道1～3）DNA質(zhì)量差。

2.3?基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

用SSR引物Co107對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。由圖4可知，3種棕櫚科植物的不同處理所提取的DNA均獲得了清晰的擴(kuò)增條帶。從硅膠干燥處理樣品中提取的DNA與從鮮葉中提取的DNA采用同一引物擴(kuò)增，所得譜帶基本無差異。

3?討論

CTAB是一種強(qiáng)去污劑，能溶解細(xì)胞膜，還能有效地去除糖類雜質(zhì)。目前此法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于植物基因組DNA的提取。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，CTAB法不僅適合椰子、油棕和檳榔等棕櫚科植物新鮮葉片的DNA提取，同時(shí)也適合棕櫚科植物硅膠干燥葉片的DNA提取。

本研究在DNA提取的過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮葉片在研磨時(shí)較干燥葉片更容易些;新鮮葉片在研磨完成時(shí)須快速轉(zhuǎn)入離心管中，并添加含有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和β-巰基乙醇的提取液，否則容易引起褐化，而干燥葉片研磨后也不易褐化，這與何天明等的研究結(jié)果[6]相同;新鮮葉片置冰箱冷凍后取出，有凍傷現(xiàn)象，出現(xiàn)水漬狀，而干燥葉片無此現(xiàn)象。

紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果表明，從硅膠干燥處理的葉片樣品中提取的DNA，純度較高，其D260 nm/D280 nm值為1.70～190，D260 nm/D230 nm值約為2.0，與從新鮮葉片樣品中提取的DNA無明顯差異，這與李學(xué)營等的研究結(jié)果[4，7，11]相似，表明葉片干燥處理后置于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）短期保存（3個(gè)月），其DNA質(zhì)量也無明顯差異。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)一步表明，硅膠干燥處理的葉片仍能提取出高質(zhì)量的DNA，除檳榔的DNA略有降解外，椰子和油棕干燥處理的葉片提取的DNA與對(duì)照組無明顯差異，表明葉片干燥處理后短期保存（3個(gè)月）于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）條件下，其DNA質(zhì)量也無明顯差異。通過SSR-PCR擴(kuò)增檢測，發(fā)現(xiàn)所有提取的DNA均能擴(kuò)增出清晰一致的條帶，進(jìn)一步表明從硅膠干燥處理葉片中提取的DNA質(zhì)量較好，能滿足分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求，這對(duì)遠(yuǎn)距離取樣研究棕櫚科植物居群遺傳多樣性是很有用的。

4?結(jié)論

從硅膠干燥處理的棕櫚科植物葉片樣品中提取的DNA質(zhì)量較好，能滿足分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求;葉片干燥處理后短期保存（3個(gè)月）于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）條件下，其DNA質(zhì)量無明顯差異;硅膠快速干燥葉片法能解決在棕櫚科植物種質(zhì)資源調(diào)查與收集時(shí)，不能及時(shí)將新鮮材料帶回實(shí)驗(yàn)室而引起的褐化問題，同時(shí)干燥后的葉片長期保存不易變質(zhì)，在DNA提取過程中也不易產(chǎn)生褐化。因此，硅膠干燥法是一種簡便實(shí)用的理想方法。

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