李生慶,張西云,李淑萍,胡國元,王亭亭,劉懷新,葉明俊,賈 苗

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧810016;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系,青海 西寧 810016)

諾維氏梭菌(Clostridium Novyi),是一種廣泛分布于自然界中的條件性致病菌,是革蘭染色陽性、兩端鈍圓的粗大桿菌。本病主要發(fā)生在肝片吸蟲流行的低洼潮濕地區(qū)。本病的發(fā)生經(jīng)常與肝片吸蟲感染密切相關(guān)[1],主要集中在4 月份和9、10 月份,青海省海北州海晏縣和海西州烏蘭縣近幾年連續(xù)報(bào)道了由B 型諾維氏梭菌引起的大量羊只急性死亡[2-3],目前該病已廣泛分布于世界各地,嚴(yán)重危害各國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。

目前,對于該病主要采取疫苗免疫預(yù)防為主,然而,在本省曾多次發(fā)生免疫羊只發(fā)病的現(xiàn)象,我們推測可能是疫苗免疫原性及免疫保護(hù)不夠?qū)е卵蚝谝叩倪B續(xù)發(fā)生,為了提高羊黑疫疫苗的免疫保護(hù)力,我們從青藏高原牧區(qū)病死羊體內(nèi)分離的5 株野毒株中篩選具有高免疫原性的B 型諾維氏梭菌菌株,并進(jìn)行16S rRNA 分子鑒定及菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,通過產(chǎn)毒試驗(yàn)及免疫試驗(yàn),篩選出具有代表性的1 株TB05 野毒菌株,研制成地方菌株羊黑疫菌苗,家兔及本動物免疫試驗(yàn)證明,該菌具有良好的培養(yǎng)特性及免疫原性,可替代現(xiàn)有制苗用菌株。本試驗(yàn)對高原牧區(qū)放牧綿羊羊黑疫的預(yù)防控制起到至關(guān)重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 TB05、WB1、S6、G4、HF 地方分離菌株均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存;C614,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 昆明系小鼠,體重16～18 g,購自青海省地方病研究所小動物繁殖基地;試驗(yàn)家兔,體重2～3 kg,購自青海省互助縣家兔養(yǎng)殖基地;試驗(yàn)羊,體重20～25 kg,由青海省海北州順倉牛羊繁育基地提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將6 株B 型諾維氏梭菌接種于加生肝塊的自制VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)72 h,抹片鏡檢。

1.2.2 B 型諾維氏梭菌基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及序列分析 基因組DNA 提?。喝?.2 mL 上述7 株B 型諾維氏梭菌48 h 純培養(yǎng)物于1.5 mL 離心管中,12 000 r/min 離心1 min,棄取上清液,按DNA提取試劑盒要求提取基因組DNA。

基因組16S rRNA PCR 擴(kuò)增：采用16S rRNA 通用引物P1 和P2,引物序列分別：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。以提取的7 株諾維氏梭菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng) 在50 μL體系中進(jìn)行,擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min、95 ℃30 s、54 ℃45 s、72 ℃1 min,30 個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收：利用OMEGA 公司購買的Gel Extraction Kit 按說明書提取目的片段,電泳檢測后送樣測序。并采用DNASTAR 軟件對基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過NCBI 提供的BLAST 在線搜索服務(wù)軟件獲取其他產(chǎn)氣莢膜梭菌(魏氏梭菌、B 型諾魏氏梭菌)16S rRNA 基因組核酸序列。使用MEGA5.0 軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對基因序列進(jìn)行分析,選擇鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析不同分離株諾維氏梭菌基因間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 諾維氏梭菌α 毒素基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 公布的B 型諾維氏梭菌α 毒素基因序列而設(shè)計(jì)一對引物P3 和P4,引物序列分別為：P3：5′-AAATTCAAGGAGGAATTTTA-3′;P4：5′-TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC-3′;以提取的諾維氏梭菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)在50 μL 體系中進(jìn)行,擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min、94 ℃1 min、58 ℃45 s、72 ℃1.5 min,30 個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。

1.2.5 菌種毒力測定 將上述經(jīng)VF 培養(yǎng)基適應(yīng)的6 株菌接種于未加生肝、含1.0%糖的VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)72 h,抹片、鏡檢,抽樣,4 000 r/min 離心20 min,遞倍稀釋后,小鼠靜脈注射測定毒力。

1.2.6 TB05 地方菌株菌苗的制備及免疫效果檢測 羊黑菌苗制備：利用高產(chǎn)毒TB05 地方菌株及C614 標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行大瓶培養(yǎng),72 h 后,按0.5%劑量加入甲醛,置于37 ℃殺菌、脫毒72 h,經(jīng)無菌檢驗(yàn)后,按菌液5 份+鋁膠1 份(每毫升菌苗含氫氧化鋁為7 mg 的量),充分混合,分裝待用。

家兔免疫攻毒試驗(yàn)及血清抗體效價(jià)測定：取體重1.5～2.0 kg 健康兔44 只,分別用上述兩種自制疫苗免疫家兔0.1 mL、0.5 mL,每組皮下注射家兔4 只,免疫21 d 后,耳靜脈采血分離血清、并按家兔最小致死量300 MLD/mL(小鼠靜脈注射)攻毒,記錄死亡情況。

本動物免疫試驗(yàn)：利用上述兩種疫苗各2 mL皮下注射綿羊10 只,羊只免疫21 d 及1、2、3 個(gè)月及6 個(gè)月后,頸靜脈采血3～5 mL,4 ℃冰箱過夜,待血清析出后,按組別吸出血清待用,測定血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)觀察 在VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,革蘭染色呈陽性,菌體兩端鈍圓,呈粗桿狀(見中插彩版圖1);培養(yǎng)72 h 可見芽孢體。在含1.0%葡萄糖、pH 值8.4～8.6 的VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,顯微鏡下為錯(cuò)粗大的梭狀芽孢體(見中插彩版圖2)。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)下的菌體形態(tài)

圖2 特殊培養(yǎng)條件下的菌體形態(tài)

2.2 諾魏氏梭菌基因組16S rRNA 基因擴(kuò)增與序列分析結(jié)果

2.2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 6 株產(chǎn)氣莢膜梭菌獲取的菌體DNA 經(jīng)16S rRNA 通用引物PCR 后擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝電泳檢測,結(jié)果顯示,6 株菌均在1 450 bp 處出現(xiàn)條帶,與預(yù)期的片段大小一致(如圖3 所示)。

圖3 5 株地方分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 基因組序列測定與同源性比較 將PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司測序。并利用DNAStar 軟件將得到的序列與GenBank公布的B 型諾維氏梭菌參考毒株進(jìn)行比對,并進(jìn)行同源性分析,結(jié)果表明,其中的5 株菌的基因與參考菌株(Clostridium novyi)基因高度同源性均在99.5%以上(見圖4)。

圖4 基于B 型諾魏氏梭菌地方分離菌株16S rRNA 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 諾魏氏梭菌α 毒素基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用設(shè)計(jì)的B 型諾維氏梭菌α 毒素特異性引物,并以6 株菌獲得的DNA 為模板,采用PCR 擴(kuò)增得到α毒素基因。從圖5 可以看出,PCR 產(chǎn)物α 毒素基因大小為530 bp,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符,說明6 株菌均為B型諾維氏梭菌。

2.4 菌種毒力測定 6 株B 型諾維氏梭菌在同一培養(yǎng)條件下的產(chǎn)毒素能力如圖6 所示,其中TB05地方菌株產(chǎn)毒能力最高,平均可達(dá)40 000 MLD/mL,與其他菌株的產(chǎn)毒能力差異極顯著(P＜0.01)。

2.5 菌苗免疫效力檢驗(yàn)

2.5.1 免疫家兔血清抗體效價(jià)測定 TB05 磷酸鋁苗0.5 mL 免疫組0.1 mL 血清最高可中和300 個(gè)MLD(小鼠最小致死量),而對照組最高只能中和100 個(gè)MLD;TB05 磷酸鋁苗0.1 mL 免疫組0.1 mL血清最高可中和200 個(gè)MLD(小鼠最小致死量),而對照組最高只能中和100 個(gè)MLD(見圖7)。

圖5 5 株地方分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株α 毒素PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖6 不同菌株的產(chǎn)毒素能力對比

圖7 兩種菌苗免疫家兔體內(nèi)血清抗體效價(jià)比較

2.5.2 綿羊免疫血清抗體測定結(jié)果 免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL(小鼠最小致死量),免疫180 d 后0.1 mL 血清仍可中和50 MLD/mL。而對照組免疫21 d 后,0.1 mL 血清只能中和大于50 MLD/mL(小鼠最小致死量),在3 個(gè)月后,基本無保護(hù)效力,差異顯著(見圖8)。

圖8 免疫羊體內(nèi)血清抗體效價(jià)變化

3 討論

疫苗制備過程中,高產(chǎn)毒菌株的篩選至關(guān)重要。本研究先通過對青藏高原牧區(qū)病死羊病料中分離的B 型諾韋氏梭菌進(jìn)行細(xì)菌生物學(xué)特性分析,分析了a 毒素基因序列并構(gòu)建了16S rRNA 的系統(tǒng)進(jìn)化樹,系統(tǒng)發(fā)育樹表明5 株地方菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株C614 相距很近,說明親緣性非常高。之后通過大量的試驗(yàn),比較5 株病原菌株的致病力差異,產(chǎn)毒量差異,最終篩選出產(chǎn)毒量最高培養(yǎng)穩(wěn)定、免疫原性好的TB05 菌株作為疫苗候選株。

在由產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的眾多家畜“猝死癥”的研究報(bào)道中,外毒素一直被認(rèn)為是致動物死亡的主要原因之一[4]。B 型諾維氏梭菌α 毒素是造成動物死亡的主要毒素,在20 世紀(jì)中葉,很多科研工作者開始致力于探索疫苗接種用于預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌病的可能性。α 類毒素的研究始于20 世紀(jì)30 年代,大約在二戰(zhàn)時(shí)期達(dá)到頂峰[5]。此種病的免疫關(guān)鍵在于動物體內(nèi)抗毒素水平的高低,因此在生產(chǎn)B 型諾維氏梭菌滅活疫苗時(shí),首先要求制苗菌液中毒素的毒力達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),才能得到高效疫苗,獲得良好的免疫效果。本研究對分離自高原牧區(qū)的5 株野毒菌株及1 株標(biāo)準(zhǔn)菌株的產(chǎn)毒能力進(jìn)行了對比分析,在合適的培養(yǎng)基上,TB05 野毒菌株的產(chǎn)毒能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株的產(chǎn)毒能力,且產(chǎn)毒穩(wěn)定性高,平均能達(dá)到4 萬MLD/mL,遠(yuǎn)高于現(xiàn)用疫苗規(guī)程規(guī)定的4 000～10 000 MLD/mL 的產(chǎn)毒最低要求[6],用此菌株所產(chǎn)毒素制成的羊黑疫疫苗其對家兔及綿羊的免疫保護(hù)力同樣優(yōu)于對照組的現(xiàn)用疫苗的保護(hù)力。證明該野毒菌株具有替代現(xiàn)用羊黑疫疫苗生產(chǎn)菌株的潛在趨勢。

諾維氏梭菌雖同屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌,但其培養(yǎng)及產(chǎn)毒特性與其他菌存在明顯差異,本試驗(yàn)在確定了疫苗候選株之后,對培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分進(jìn)行了摸索和改良。本試驗(yàn)通過對產(chǎn)毒過程的觀察以及間斷性取樣檢測及毒力測定,確定在培養(yǎng)后72 h 作為抗原的收獲時(shí)間。其次,通過不同pH 值對產(chǎn)毒的影響試驗(yàn)測得,該菌株最適產(chǎn)毒pH 值在8.2～8.4,這與報(bào)道,pH 值6.5～7.5 是產(chǎn)氣莢膜梭菌生長和毒素產(chǎn)生的最佳pH 值條件[7]有一定差異。

同時(shí),通過不同碳源加入量對產(chǎn)毒的影響試驗(yàn),測得在含1.0%葡萄糖的培養(yǎng)基上,產(chǎn)毒最高,這與文獻(xiàn)報(bào)道的易消化的碳水化合物像葡萄糖或糊精,均可提高產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)毒量[8]的論述相一致。

由于該菌導(dǎo)致的疫病具有發(fā)病急、病程短、死亡率高等特點(diǎn),藥物治療很難達(dá)到效果,因此疫苗預(yù)防是控制該病的主要手段[9]。20 世紀(jì)80 年代初,我國成功研制出產(chǎn)氣莢膜梭菌病的單價(jià)苗和多聯(lián)滅活疫苗,在預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疫病方面發(fā)揮了重要作用。如中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所文希韶等,在浙江杭嘉地區(qū)發(fā)生的急性傳染病采集病原菌,研制了綿羊(湖羊)黑疫快疫混合疫苗,3 批苗免疫羊除第3 批1 只羊未保護(hù)外,2 mL 免疫劑量可抵抗100 MLD 攻毒劑量,免疫效果良好[10]。本試驗(yàn)中,利用TB05 地方菌株制備的羊黑疫菌苗免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL 的毒素量,免疫效果更佳。因此,該地方菌株可作為生產(chǎn)羊黑疫疫苗的備用菌株。