文／本刊記者 王 郁

今年1月4號，北京大學物理學院人工微結構和介觀物理國家重點實驗室、前沿交叉學科研究院定量生物學中心毛有東課題組在《自然》雜志上發(fā)表了題為《底物結合的人源26S蛋白酶體的冷凍電鏡結構和動力學》的長論文，通過冷凍電子顯微鏡和機器學習技術的結合，解析了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間態(tài)構象的高分辨（2.8～3.6埃）精細原子結構，局部分辨率最高達到2.5埃。

這些三維結構展現了驚人的時空連續(xù)性，生動呈現了原子水平的蛋白酶體和底物相互作用的動態(tài)過程，首次實現了對三磷酸腺苷酶（AAA-ATPase）六聚馬達分子內三磷酸腺苷（ATP）水解全周步進循環(huán)完整過程的原子水平觀測和三維建模，發(fā)現三種不同的ATP水解協(xié)同反應模式，及其如何調控蛋白酶體復雜多樣的功能。

論文解決了一系列長期懸而未決的重要科學問題：蛋白酶體如何進行泛素識別和去泛素化；三磷酸腺苷酶分子馬達如何打開其軸心通道并與底物結合；底物轉運如何啟動；三磷酸腺苷酶馬達如何將化學能轉化為機械能，進而實現底物解折疊的協(xié)同動力學機制。

這是《自然》雜志首次發(fā)表系統(tǒng)性、優(yōu)于3.6埃分辨率水平實驗研究超大復合蛋白質機器的動力學過程和原理的論文，標志冷凍電鏡的發(fā)展開始進入全原子動力學分析的新“里程”?！蹲匀弧冯s志編輯部和審稿人對該論文的發(fā)表高度重視，從9月12日投稿、審稿到11月12日正式在線發(fā)表，用時僅兩個月時間。

蛋白酶體如何實現底物降解的原子水平工作機制亟待突破

該論文通訊作者、北京大學教授毛有東介紹，泛素-蛋白酶體體系是細胞內最重要的蛋白質降解通路，對維持生物體內蛋白質的濃度平衡，以及對調控蛋白、錯誤折疊或受到損傷的蛋白的快速降解起著至關重要的作用，參與了細胞周期、基因表達調控等多種細胞進程，由UPS失常引發(fā)的蛋白質新陳代謝異常與眾多人類重大疾病直接相關。

2004年，Aaron Ciechanover、Irwin Rose和Avram Hershko三位科學家被授予了諾貝爾化學獎，以表彰他們對該降解通路的發(fā)現。在該通路的終端由蛋白酶體負責蛋白質的降解，它是細胞中最基本、最重要、最復雜且不可或缺的大型全酶超分子復合機器之一，人源蛋白酶體全酶包含至少33種不同的亞基，總分子量約為2.5MDa。

毛有東說，美國FDA批準的多種治療癌癥的藥物分子即以蛋白酶體為直接靶標。近年來，隨著冷凍電鏡技術的發(fā)展和應用，人們對這一大分子機器的結構和功能研究得以不斷深入。2016年，毛有東課題組與合作者報道了人源蛋白酶體基態(tài)的3.6埃冷凍電鏡結構及其它三個亞納米分辨構象，首次發(fā)現了一個亞穩(wěn)態(tài)構象的核心顆粒底物轉運通道處于開放狀態(tài)。

2018年4月，該課題組又報道了六個ATPγS結合狀態(tài)下的26S動態(tài)結構，包括三個核心顆粒亞基開放態(tài)對應的亞穩(wěn)簡并態(tài)近原子分辨（4～5埃）結構。盡管這些工作揭示了蛋白酶體的基本架構和內在運動行為，但由于缺乏蛋白酶體與底物之間的相互作用，人們對于蛋白酶體如何實現底物降解的原子水平工作機制仍一無所知。

“此外，盡管冷凍電鏡技術近年來廣泛應用于分析具有動態(tài)特征的蛋白復合體結構和平衡態(tài)構象，但對其中間態(tài)結構和非平衡構象分析的分辨率水平往往局限在4～6埃或更低，離真正的全原子水平動力學分析還有相當一段距離。”毛有東說。

完整展示蛋白酶體從泛素結合到去泛素化再到底物轉運的動態(tài)過程

該論文的共同第一作者、原課題組博士后、現為中國科學院化學所研究員董原辰博士介紹，為了真正實現原子水平的蛋白酶體底物降解動態(tài)過程的冷凍電鏡三維重建和動力學表征，課題組攻克了兩大技術難題。

其一，如何在蛋白酶體完成底物降解之前抓到它所有可能的中間態(tài)構象。課題組發(fā)展了一種新穎的三磷酸腺苷（ATP）置換法，利用ATPγS降低三磷酸腺苷酶水解活性的特點，在底物降解中間過程，通過將ATP快速置換成ATPγS，結合快速冷凍的優(yōu)勢，從而撲捉到蛋白酶體在底物降解過程的中間態(tài)。

其二，在從冷凍電鏡數據中分析出更多構象的同時，如何把分辨率做到3埃甚至更好。課題組通過多年持續(xù)努力，發(fā)展了多種基于人工智能和機器學習的冷凍電鏡圖像聚類的新型算法，并針對蛋白酶體的動力學特征，設計了一套極其有效的整合了多種算法的多構象分類流程。

董原辰說，通過這兩套技術方案的完美結合，課題組成功解析了人源蛋白酶體在降解底物過程中七種不同的、但差別甚微的、高分辨原子水平的天然態(tài)構象，完整展示了蛋白酶體從泛素結合到去泛素化，再到底物轉運的動態(tài)過程。與同期在《科學》發(fā)表的與底物結合的酵母蛋白酶體的4.2～4.7埃冷凍電鏡結構相比，這篇《自然》論文不僅在總構象數量上多一倍，全部構象分辨率還高1～2埃。

由于《科學》論文采用了抑制Rpn11去泛素活性的策略，其非天然態(tài)結構中底物并不能真正自由轉運，所推測的機理僅限于底物轉運這一步，對于其它三大《自然》論文所回答重要問題均無法給出答案。這體現了該篇《自然》論文不僅在實驗方法的原創(chuàng)性及數據分析水平和質量上，還在科學發(fā)現和問題探究的深度和廣度上大幅超越了來自《科學》的競爭性論文。

北大冷凍電鏡平臺在數據采集效率和成像分辨率等各方面均已達到國際領先水平

該論文的共同第一作者、課題組博士生張書文介紹，作為整個蛋白酶體的動力來源與運轉核心，三磷酸腺苷酶分子馬達展現出了三種不同的ATP水解協(xié)作模式，六個三磷酸腺苷酶亞基協(xié)調工作，交替與底物發(fā)生相互作用。在去泛素化過程中，處于對立位置的兩個三磷酸腺苷酶亞基Rpt2與Rpt4水解ATP，而Rpt5與Rpt6則釋放ADP，三磷酸腺苷酶內的底物轉運通道被打開，使得底物可以進入軸心通道。

與此同時，去泛素化酶Rpn11亞基與泛素及底物發(fā)生相互作用，執(zhí)行其作為去泛素化酶的功能；在轉運起始過程中，相鄰的兩個三磷酸腺苷酶亞基Rpt1與Rpt5同時水解ATP，調控顆粒發(fā)生大規(guī)模轉動并釋放泛素；在底物去折疊與轉運過程中，三個相鄰的三磷酸腺苷酶亞基會分別同步進行ATP的結合、ADP的釋放與ATP的水解，這一過程會單向傳遞下去，將ATP水解釋放的化學能轉換為機械能，使得相應的三磷酸腺苷酶亞基發(fā)生剛體轉動，推動底物的去折疊和單向輸運，同時核心顆粒亞基的轉運通道入口打開，底物被送入通道中進行降解。

毛有東說，這些研究結果為幾十年來對蛋白酶體功能的研究提供了寶貴的第一手原子結構和動力學信息，對于理解生物體內蛋白質的降解過程和一系列負責物質輸運的三磷酸腺苷酶馬達分子的一般工作原理具有極為重要的科學意義。

記者了解到，北京大學物理學院人工微結構和介觀物理國家重點實驗室為這篇論文的第一完成單位，該研究工作的全部冷凍電鏡數據均在北京大學電子顯微鏡實驗室和北大冷凍電鏡平臺完成采集，大部分數據分析工作在北大高性能計算平臺上完成。論文的發(fā)表標志著北大冷凍電鏡平臺建設后來居上，在數據采集效率和成像分辨率等各方面均已達到國際領先水平，具備了相當的國際競爭力。同時，這項研究得到國家自然科學基金委、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、美國Intel公司并行計算研究基金、美國國家健康研究院的資助。