王娜　佟鳳芝　曾常茜

【摘 要】目的：觀察海人酸活化BV-2小膠質細胞的增殖，通過P38MAPK/AP-1信號通路探討海人酸活化BV-2小膠質細胞增殖的相關分子機制。方法：BV-2細胞隨機分為對照組、海人酸組，用倒置顯微鏡觀察各組BV-2細胞數量及形態(tài);用免疫組化法檢測各組BV-2細胞c-Jun、c-Fos和P38蛋白的表達。結果：倒置顯微鏡結果顯示，海人酸組與對照組相比，BV-2細胞數量增加，胞體變大變圓，突起變短或消失;免疫組化結果顯示，對照組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.041±0.003;海人酸組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.805±0.029，較對照組顯著增加（P<0.05）;對照組BV-2細胞c-Fos蛋白表達陽性率為0.039±0.003;海人酸組BV-2細胞c-Fos蛋白表達陽性率為0.784±0.028，較對照組顯著增加（P<0.05）;對照組BV-2細胞p38蛋白表達陽性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細胞p38蛋白表達陽性率為0.438±0.014，較對照組顯著增加（P<0.05）。結論：海人酸活化的BV-2細胞增殖，其分子機制可能與上調P38MAPK/AP-1信號通蛋白表達有關。

【關鍵詞】BV-2小膠質細胞;增殖;P38MAPK;AP-1

【中圖分類號】R282【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）22--01

癲癇是大腦神經元異樣放電誘發(fā)的腦功能障礙疾病[1]。癲癇的病因之一是小膠質細胞的數量及形態(tài)異常，導致細胞殘骸積累和炎癥反應增加[2]。所以，深入研究小膠質細胞增殖價值是防治癲癇的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗檢測海人酸活化小膠質細胞P38MAPK、AP-1蛋白表達，旨在揭示海人酸活化小膠質細胞的分子機制。

1 材料

BV-2小膠質細胞株由中國醫(yī)科大學提供。兔抗小鼠p38蛋白抗體、兔抗小鼠c-Jun抗體、羊抗兔HRP-IgG抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、海人酸、DAB 顯色劑均購自試劑公司。

2 方法

2.1 細胞的實驗分組

將BV-2細胞隨機分為對照組、海人酸組。

2.2 倒置顯微鏡觀察BV-2細胞增殖

BV-2細胞5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，分為二組，觀察小膠質細胞數量及形態(tài)。

2.3 免疫組化法檢測BV-2細胞c-Jun，c-Fos和P38蛋白表達

將處于對數生長期的BV-2細胞分為三組，PBS清洗后，多聚甲醛處理，曲拉通固定，H2O2孵育，羊血清封閉。再加入兔抗小鼠c-Jun 抗體、兔抗小鼠p38蛋白抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體，4 ℃冰箱中過夜，次日PBS沖洗后加入羊抗兔HRP-IgG抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.4 統計分析

實驗數據采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異具有顯著性。

3 結果

3.1 海人酸活化BV-2細胞的增殖

結果見圖1。倒置顯微鏡下可見對照組（圖A）BV-2細胞貼壁，形態(tài)規(guī)則，體積瘦小，突起細而長。海人酸組（圖B）與對照組相比，BV-2細胞數量較多，且生長密集成團，細胞體積變大變圓，突起變短或消失。

3.2 海人酸活化BV-2細胞c-Jun蛋白、c-Fos蛋白及p38蛋白的表達

結果見表1。對照組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.041±0.003，c-Fos蛋白表達陽性率為0.039±0.003，p38蛋白表達陽性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.805±0.029，c-Fos蛋白表達陽性率為0.784±0.028，p38蛋白表達陽性率為0.438±0.014，結果均高于對照組（P<0.05）。

4 討論

4.1 海人酸活化小膠質細胞的增殖

Benson MJ等[3]用海人酸建立小鼠癲癇模型，用流式細胞術檢測到小鼠海馬M1小膠質細胞數量明顯增多。本實驗用海人酸體外作用BV-2細胞，發(fā)現海人酸組與對照組比較胞體增大，突起減少甚至不見，細胞分布密集，數量明顯增多，表明海人酸可以促進BV-2細胞增殖。

4.2 海人酸活化小膠質細胞p38蛋白的表達

p38是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中重要的亞家族，參與轉錄調控、細胞增殖、凋亡等病理過程。Hwang CJ等[4]研究發(fā)現ERα基因缺陷小鼠小膠質細胞活性增加，表明小膠質細胞參與神經損傷性疾病可能與p38蛋白高表達有關。本實驗免疫組化測定細胞p38蛋白陽性率顯著增高，表明p38蛋白可能參與了小膠質細胞活化。

4.3 海人酸活化小膠質細胞AP-1蛋白的表達

AP-1由c-Fos和c-Jun形成的同源或異源二聚體構成，作用于基因轉錄調控，參與細胞的分裂增殖[5]。Meade AJ等[6]用海人酸處理小膠質細胞，模擬癲癇發(fā)病模型，發(fā)現小膠質細胞死亡數量明顯下降。本實驗通過海人酸體外刺激小膠質細胞，結果發(fā)現免疫組化測定細胞c-Jun和c-Fos蛋白陽性率顯著增高，表明AP-1蛋白可能參與了癲癇小膠質細胞活化。

綜上，海人酸促進BV-2細胞增殖可能與上調P38MAPK/AP-1信號通蛋白表達有關，此為進一步揭示小膠質細胞增殖的分子機制提供了實驗依據。有關海人酸活化小膠質細胞對其他信號通路的作用機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

參考文獻

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Diazaparicio I， Beccari S， Abiega O， et al.Clearing the corpses： regulatory mechanisms， novel tools， and therapeutic potential of harnessing microglial phagocytosis in the diseased brain[J].Neural Regeneration Research， 2016， 11（10）：1533-1539.

Benson MJ， Manzanero S， Borges K.Complex alterations in microglial M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models[J].Epilepsia， 2015， 12（9）： 21-60.

Hwang CJ， Choi DY， Jung YY， et al.Inhibition of p38 pathway-dependent MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in estrogen receptor alpha knockout mice[J].Horm Behav.2016，80：19-29.

Wagner E F.AP-1-Introductory remarks.[J].Oncogene， 2001， 20（19）：2334-2335.

Meade A J， Meloni B P， Mastaglia F L， et al.AP-1 inhibitory peptides attenuate in vitro cortical neuronal cell death induced by kainic acid.[J].Brain Research， 2010， 1360（1）：8-16.