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        海人酸促進小膠質細胞增殖的P38MAPK/AP-1信號通路的研究

        2019-11-27 23:06:33王娜佟鳳芝曾常茜
        健康大視野 2019年22期
        關鍵詞:小鼠

        王娜 佟鳳芝 曾常茜

        【摘 要】目的:觀察海人酸活化BV-2小膠質細胞的增殖,通過P38MAPK/AP-1信號通路探討海人酸活化BV-2小膠質細胞增殖的相關分子機制。方法:BV-2細胞隨機分為對照組、海人酸組,用倒置顯微鏡觀察各組BV-2細胞數量及形態(tài);用免疫組化法檢測各組BV-2細胞c-Jun、c-Fos和P38蛋白的表達。結果:倒置顯微鏡結果顯示,海人酸組與對照組相比,BV-2細胞數量增加,胞體變大變圓,突起變短或消失;免疫組化結果顯示,對照組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.041±0.003;海人酸組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.805±0.029,較對照組顯著增加(P<0.05);對照組BV-2細胞c-Fos蛋白表達陽性率為0.039±0.003;海人酸組BV-2細胞c-Fos蛋白表達陽性率為0.784±0.028,較對照組顯著增加(P<0.05);對照組BV-2細胞p38蛋白表達陽性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細胞p38蛋白表達陽性率為0.438±0.014,較對照組顯著增加(P<0.05)。結論:海人酸活化的BV-2細胞增殖,其分子機制可能與上調P38MAPK/AP-1信號通蛋白表達有關。

        【關鍵詞】BV-2小膠質細胞;增殖;P38MAPK;AP-1

        【中圖分類號】R282【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019(2019)22--01

        癲癇是大腦神經元異樣放電誘發(fā)的腦功能障礙疾病[1]。癲癇的病因之一是小膠質細胞的數量及形態(tài)異常,導致細胞殘骸積累和炎癥反應增加[2]。所以,深入研究小膠質細胞增殖價值是防治癲癇的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗檢測海人酸活化小膠質細胞P38MAPK、AP-1蛋白表達,旨在揭示海人酸活化小膠質細胞的分子機制。

        1 材料

        BV-2小膠質細胞株由中國醫(yī)科大學提供。兔抗小鼠p38蛋白抗體、兔抗小鼠c-Jun抗體、羊抗兔HRP-IgG抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、海人酸、DAB 顯色劑均購自試劑公司。

        2 方法

        2.1 細胞的實驗分組

        將BV-2細胞隨機分為對照組、海人酸組。

        2.2 倒置顯微鏡觀察BV-2細胞增殖

        BV-2細胞5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,分為二組,觀察小膠質細胞數量及形態(tài)。

        2.3 免疫組化法檢測BV-2細胞c-Jun,c-Fos和P38蛋白表達

        將處于對數生長期的BV-2細胞分為三組,PBS清洗后,多聚甲醛處理,曲拉通固定,H2O2孵育,羊血清封閉。再加入兔抗小鼠c-Jun 抗體、兔抗小鼠p38蛋白抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體,4 ℃冰箱中過夜,次日PBS沖洗后加入羊抗兔HRP-IgG抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體,PBS沖洗。DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠封片,鏡下觀察。

        2.4 統計分析

        實驗數據采用SPSS17.0統計軟件,計量資料以()表示,組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異具有顯著性。

        3 結果

        3.1 海人酸活化BV-2細胞的增殖

        結果見圖1。倒置顯微鏡下可見對照組(圖A)BV-2細胞貼壁,形態(tài)規(guī)則,體積瘦小,突起細而長。海人酸組(圖B)與對照組相比,BV-2細胞數量較多,且生長密集成團,細胞體積變大變圓,突起變短或消失。

        3.2 海人酸活化BV-2細胞c-Jun蛋白、c-Fos蛋白及p38蛋白的表達

        結果見表1。對照組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.041±0.003,c-Fos蛋白表達陽性率為0.039±0.003,p38蛋白表達陽性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細胞c-Jun蛋白表達陽性率為0.805±0.029,c-Fos蛋白表達陽性率為0.784±0.028,p38蛋白表達陽性率為0.438±0.014,結果均高于對照組(P<0.05)。

        4 討論

        4.1 海人酸活化小膠質細胞的增殖

        Benson MJ等[3]用海人酸建立小鼠癲癇模型,用流式細胞術檢測到小鼠海馬M1小膠質細胞數量明顯增多。本實驗用海人酸體外作用BV-2細胞,發(fā)現海人酸組與對照組比較胞體增大,突起減少甚至不見,細胞分布密集,數量明顯增多,表明海人酸可以促進BV-2細胞增殖。

        4.2 海人酸活化小膠質細胞p38蛋白的表達

        p38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中重要的亞家族,參與轉錄調控、細胞增殖、凋亡等病理過程。Hwang CJ等[4]研究發(fā)現ERα基因缺陷小鼠小膠質細胞活性增加,表明小膠質細胞參與神經損傷性疾病可能與p38蛋白高表達有關。本實驗免疫組化測定細胞p38蛋白陽性率顯著增高,表明p38蛋白可能參與了小膠質細胞活化。

        4.3 海人酸活化小膠質細胞AP-1蛋白的表達

        AP-1由c-Fos和c-Jun形成的同源或異源二聚體構成,作用于基因轉錄調控,參與細胞的分裂增殖[5]。Meade AJ等[6]用海人酸處理小膠質細胞,模擬癲癇發(fā)病模型,發(fā)現小膠質細胞死亡數量明顯下降。本實驗通過海人酸體外刺激小膠質細胞,結果發(fā)現免疫組化測定細胞c-Jun和c-Fos蛋白陽性率顯著增高,表明AP-1蛋白可能參與了癲癇小膠質細胞活化。

        綜上,海人酸促進BV-2細胞增殖可能與上調P38MAPK/AP-1信號通蛋白表達有關,此為進一步揭示小膠質細胞增殖的分子機制提供了實驗依據。有關海人酸活化小膠質細胞對其他信號通路的作用機制尚不清楚,有待進一步深入研究。

        參考文獻

        Ngugi AK, Bottomley C, Fegan G,et al.Premature mortality in active convulsive epilepsy in rural Kenya: Causes and associated factors[J].Neurology, 2014, 82(7): 582-589.

        Diazaparicio I, Beccari S, Abiega O, et al.Clearing the corpses: regulatory mechanisms, novel tools, and therapeutic potential of harnessing microglial phagocytosis in the diseased brain[J].Neural Regeneration Research, 2016, 11(10):1533-1539.

        Benson MJ, Manzanero S, Borges K.Complex alterations in microglial M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models[J].Epilepsia, 2015, 12(9): 21-60.

        Hwang CJ, Choi DY, Jung YY, et al.Inhibition of p38 pathway-dependent MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in estrogen receptor alpha knockout mice[J].Horm Behav.2016,80:19-29.

        Wagner E F.AP-1-Introductory remarks.[J].Oncogene, 2001, 20(19):2334-2335.

        Meade A J, Meloni B P, Mastaglia F L, et al.AP-1 inhibitory peptides attenuate in vitro cortical neuronal cell death induced by kainic acid.[J].Brain Research, 2010, 1360(1):8-16.

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