張業(yè)霞，張佳倫，邵文錦，趙 晶，李淑敏

(菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校：1.免疫與微生物學(xué)教研室；2.學(xué)報(bào)編輯部；3.預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，山東菏澤 274000;4.菏澤市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東菏澤 274000)

大腸癌又稱結(jié)直腸癌，是源自腸黏膜上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全球逐漸增加，已上升到癌癥發(fā)病率的第3位。由于其高發(fā)病率、惡性行為、缺乏治療策略的重大進(jìn)展，且不同的臨床病理特征可能會(huì)影響結(jié)直腸癌的預(yù)后，早期預(yù)防和早期診斷對(duì)控制結(jié)直腸癌的發(fā)病及預(yù)后非常關(guān)鍵。常見(jiàn)的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原CEA)、糖鏈抗原19-9(CA19-9)等已廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的篩查、輔助診斷和療效判斷，但其存在著診斷靈敏度或特異度不足的缺陷。越來(lái)越多的證據(jù)表明，很多遺傳標(biāo)志對(duì)結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為有重要影響，某些基因在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的各個(gè)方面，如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑癌基因的失活等密切相關(guān)。骨膜蛋白是一種重要的候選基因，研究發(fā)現(xiàn)其在多種人類(lèi)腫瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等中均過(guò)表達(dá)[1-6]。因此，為進(jìn)一步明確骨膜蛋白在結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值，了解骨膜蛋白與CEA在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)差異，探索血清骨膜蛋白在結(jié)直腸癌診斷及病情判斷中的效能，特開(kāi)展此研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取菏澤市立醫(yī)院臨床確診結(jié)直腸癌患者80例(均為病理診斷確診)為結(jié)直腸癌組，所有患者術(shù)前均未接受任何化療、放療及生物靶向治療等輔助治療措施，并排除糖尿病、高血壓、腎病等疾病。其中男49例，女31例，年齡29～75歲，中位年齡52歲；結(jié)腸癌46例，直腸癌34例；患者Dukes臨床分期：A期15例，B期31例，C期23例，D期11例；病理組織學(xué)分型：腺癌53例，黏液癌18例，未分化癌9例。無(wú)菌采集患者空腹靜脈血液樣本，室溫靜置30 min，2 500 r/min離心20 min后提取血清，低溫保存?zhèn)溆?。同時(shí)選取同期體檢健康者60例作為健康對(duì)照組，包括男37例，女23例，年齡27～73歲，中位年齡 50歲，其各項(xiàng)體檢指標(biāo)均正常。2組在性別、年齡等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，所有結(jié)直腸癌患者及健康對(duì)照者均知情同意本研究，并經(jīng)菏澤市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA，Sigma)法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照組血清中骨膜蛋白水平，采用雙抗體夾心法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。主要步驟為：將6種不同水平的Periostin標(biāo)準(zhǔn)品(0.5、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0 ng/mL)及健康對(duì)照者和結(jié)直腸癌患者血清各100 μL分別加至相應(yīng)孔(每份標(biāo)準(zhǔn)品及待檢標(biāo)本均做復(fù)孔)，將反應(yīng)板置37 ℃溫箱孵育2 h后，洗板4次。每孔分別加5 μL兔抗人Periostin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，然后置37 ℃溫箱孵育1 h，然后每孔分別加顯色液DAB和H2O2，再置37 ℃溫箱避光顯色20 min，最后加2 mol/L的H2SO4以終止反應(yīng)。設(shè)空白孔為零，于酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值(A值)。以標(biāo)準(zhǔn)品水平為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品A值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)水平，再乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出待檢血清Periostin水平。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者血清中CEA水平，原理亦是雙抗夾心法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

2 結(jié) 果

2.12組血清骨膜蛋白與CEA檢測(cè)結(jié)果 結(jié)直腸癌組血清中骨膜蛋白和CEA水平均遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2結(jié)直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平與其臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平表達(dá)在不同年齡(≥60歲、<60歲)、不同性別患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨患者臨床Dukes分期的增高，患者血清骨膜蛋白和CEA水平逐漸升高，在結(jié)直腸癌不同病理組織學(xué)類(lèi)型中，未分化癌血清骨膜蛋白和CEA水平最高，其次是黏液癌和腺癌，腫瘤分化程度越低，骨膜蛋白和CEA水平越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。

表1 2組血清骨膜蛋白與CEA檢測(cè)結(jié)果

表2 結(jié)直腸癌患者血清骨膜蛋白和CEA水平與年齡、性別的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平與臨床Dukes分期、病理組織學(xué)類(lèi)型的關(guān)系

3 討 論

骨膜蛋白是一種來(lái)源于鼠成骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)，因其在骨膜和牙周韌帶的定位表達(dá)而被稱為骨膜蛋白,由811個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[1]。研究發(fā)現(xiàn)在多種人類(lèi)腫瘤中，如乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等，骨膜蛋白均過(guò)表達(dá)[2-6]。人源骨膜蛋白由836個(gè)氨基酸殘基組成，基因定位于第13號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，大小約為36 kb，相對(duì)分子質(zhì)量約為93.33×103，與鼠的氨基酸同源性約為89.2%，具有高度的保守性。骨膜蛋白屬于成束蛋白家族成員，屬分泌性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它含有1個(gè)NH2-末端信號(hào)肽序列，1個(gè)胱氨酸結(jié)構(gòu)域，4個(gè)同源性重復(fù)區(qū)(120～160個(gè)氨基酸)和1個(gè)親水COOH-末端結(jié)構(gòu)域。骨膜蛋白的COOH-末端可與多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合,如膠原蛋白、纖維連接蛋白、生腱蛋白-C等，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)間的組成、相互作用、改變結(jié)締組織的生物力學(xué)特性構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等重要作用。

骨膜蛋白作為αvβ3和αvβ5整合素的配體有助于卵巢上皮細(xì)胞的黏附和遷移。骨膜蛋白通過(guò)αvβ3整合素激活A(yù)kt/PKB標(biāo)志性通路以增加細(xì)胞的生存、黏附及擴(kuò)散，整合素的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)[7]。雖然骨膜蛋白在多種腫瘤及結(jié)直腸癌中有個(gè)別報(bào)道，但其在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)研究較少，且未發(fā)現(xiàn)其與常用指標(biāo)CEA的比較分析，故開(kāi)展此研究，以期為臨床結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)尋求更可靠的腫瘤標(biāo)志物。

CEA是研究者在1965年提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，最先是從結(jié)腸癌和胚胎組織中發(fā)現(xiàn)的。它是一種酸性糖蛋白，且是構(gòu)成細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，包含641個(gè)氨基酸，存在于內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來(lái)的腫瘤細(xì)胞表面，具有人類(lèi)胚胎抗原特性。CEA的合成是在胞質(zhì)中，可穿過(guò)細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外，分布于人體周?chē)w液中，因此，可從血清、腦脊液、乳汁等多種體液標(biāo)本中檢出。CEA水平的升高常見(jiàn)于大腸癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤中，但吸煙者、妊娠期者和心血管疾病、直腸息肉、結(jié)腸炎等多種疾病中，15%～53%的患者血清CEA水平也會(huì)升高，故CEA對(duì)惡性腫瘤的診斷不具有特異性，雖然已廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的篩查、輔助診斷和療效判斷，作為早期檢測(cè)大腸癌的傳統(tǒng)血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，但受到其診斷靈敏度或特異度的限制[8]。

本研究通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者血清進(jìn)行骨膜蛋白與CEA的聯(lián)合測(cè)定，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組患者血清中骨膜蛋白與CEA的水平明顯高于健康對(duì)照組，此結(jié)果證實(shí)CEA在結(jié)直腸癌患者血清中的診斷價(jià)值，符合臨床結(jié)論，但同時(shí)也表明骨膜蛋白類(lèi)似于CEA，在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)明顯增高，同樣對(duì)結(jié)直腸癌的診斷有重要的參考價(jià)值。

基礎(chǔ)研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞常利用鄰近間質(zhì)細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白重塑出有利于原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，進(jìn)而形成便于其侵襲和遷移的轉(zhuǎn)移灶。也有研究表明，骨膜蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低氧的耐受性，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、惡性胸膜間皮瘤等中均高表達(dá)，具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增生、遷移和侵襲的能力。本研究對(duì)結(jié)直腸癌患者血清中骨膜蛋白、CEA水平與其臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，結(jié)直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平隨患者臨床Dukes分期進(jìn)展而升高，這在一定程度上說(shuō)明越是接近于結(jié)直腸癌晚期的患者，其血清中骨膜蛋白和CEA水平亦越高，特別是C期和D期的血清骨膜蛋白水平顯著高于A期和B期，與臨床研究結(jié)果相符。因此，血清中骨膜蛋白水平在提示結(jié)直腸癌患者具有侵襲和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中有重要意義，可以作為高風(fēng)險(xiǎn)的臨床指標(biāo)。但本研究也觀察到，不論處于何種臨床分期和何種腫瘤病理類(lèi)型的結(jié)直腸癌患者，其血清骨膜蛋白和CEA水平與年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究也發(fā)現(xiàn)，骨膜蛋白和CEA在不同病理組織學(xué)類(lèi)型的表達(dá)程度也不同，在未分化癌血清中骨膜蛋白和CEA水平最高，其次是黏液癌和腺癌。低分化型大腸癌血清中骨膜蛋白水平顯著高于中分化、高分化大腸癌，腫瘤分化程度越低，骨膜蛋白和CEA水平越高。此外研究還發(fā)現(xiàn)，血清骨膜蛋白和CEA水平升高的患者發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的概率較高，與臨床報(bào)道一致[9-10]，這在判斷腫瘤進(jìn)展、臨床分期、術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后等方面會(huì)有一定意義。

綜上所述，骨膜蛋白和CEA在大腸癌的診斷中具有高度的一致性，這2項(xiàng)指標(biāo)對(duì)患者病情評(píng)估和預(yù)后判斷均有重要參考價(jià)值。目前，研究者所用的多數(shù)腫瘤標(biāo)志物缺乏器官特異性，再加上不同腫瘤組織的復(fù)雜性和異質(zhì)性，單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的判斷價(jià)值有限，輔助診斷效果不佳，已不能滿足臨床需求。因此，多項(xiàng)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)已是診斷腫瘤的一個(gè)趨勢(shì)。