鄒 琳,蘭建云,宋 曙,邵偉偉,胥傳海△

(鹽城市第一人民醫(yī)院：1.轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心；2.病理科,江蘇鹽城 224001)

肺癌位居全球總人口癌癥致死率排行之首,占癌癥總患者的18.4%[1]。大多數(shù)肺癌患者在確診時已為晚期,治療難度大,病死率高。隨著分子生物學和精準醫(yī)療的飛速發(fā)展,腫瘤藥物治療已從傳統(tǒng)的放化療發(fā)展到分子靶向治療。近年來，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療晚期非小細胞肺癌患者(NSCLC)已成熟應用于臨床,患者獲益明顯,但是耐藥問題限制了藥物的治療效果[2-3]。為延長患者的壽命，亟需研發(fā)新的治療方法或藥物，目前以程序性死亡因子1(PD-1)/程序性死亡因子配體1(PD-L1)單抗為代表的封鎖免疫檢查點治療是治療晚期NSCLC最有希望的方法之一[4]，成為醫(yī)學腫瘤界研究的熱點。臨床研究已證實，對患者進行PD-L1蛋白水平的檢測，有利于患者選擇藥物。2018年第6版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡臨床實踐指南(NCCN)推薦對腫瘤患者進行更廣譜的驅(qū)動基因檢測,這其中就包括對PD-L1蛋白表達和EGFR基因狀態(tài)進行檢測。目前,國內(nèi)關于PD-L1與EGFR基因突變相關性研究的文獻報道較少。本文旨在研究93例NSCLC組織中PD-L1蛋白的表達、EGFR突變狀態(tài)及二者的相關性,以便進一步研究肺癌的發(fā)生機制,更高效篩選PD-L1蛋白檢測對象,協(xié)助指導臨床,為患者提供最合適的治療方案。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年1月鹽城市第一人民醫(yī)院病理科存檔，經(jīng)病理證實的93例NSCLC患者的蠟塊組織。93例患者中男51例,女42例;年齡39～80歲,中位年齡62歲;無吸煙史60例，有吸煙史33例;病變部位:左側40例,右側53例;腫瘤大小:≤3 cm 59例,>3 cm 34例;淋巴結轉(zhuǎn)移:無轉(zhuǎn)移者71例,有轉(zhuǎn)移者22例;組織學類型：腺癌82例,鱗癌11例;臨床TNM分期:Ⅰ期61例,Ⅱ期18例,Ⅲ期14例。組織學分化類型:低分化25例,中分化29例,高分化39例。臨床分期參照2017年國際肺癌研究中心(IASLC)第8版肺癌TNM分期解讀。組織學分析參照2006年WHO肺腫瘤組織學分類標準。

1.2試劑與儀器 PD-L1(28-8)購自美國abcam公司;內(nèi)源性過氧化物酶、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液、HRP標記抗鼠/兔二抗、DAB增強顯色系統(tǒng)均購自福建邁新公司;FFPE石蠟組織DNA提取試劑盒(56404)購自美國凱杰公司;人類EGFR29基因突變檢測試劑盒(ADx-EG01)購自廈門艾德公司。儀器包括德國蔡司Zen顯微數(shù)字成像系統(tǒng)，國產(chǎn)海爾生物安全柜，美國科威爾(Quawell 6000)超微量分光光度計，德國艾本德(Eppendorf)離心機及移液器，國產(chǎn)宏石全自動熒光定量PCR儀(SLAN96S)。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學 (1)石蠟包埋組織4 μm切片,貼于涂膠片上,60 ℃烤片2 h。二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化組織切片,EDTA高壓鍋抗原修復4 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min,滴加一抗 PD-L1(1∶100,Abcam公司)室溫孵育1 h,HRP標記的二抗(邁新公司)室溫孵育15 min。DAB顯色2～5 min,蘇木素復染1 min,流水沖洗,1%鹽酸-乙醇快速分化,大量流水沖洗,梯度乙醇水化,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察判讀并采圖。(2)結果判斷:由3位高年資醫(yī)師采用盲法判讀結果,意見不統(tǒng)一時,討論到結果一致。用正常扁桃體組織作為PD-L1蛋白染色的陽性對照(上皮隱窩著色)和陰性對照(內(nèi)皮、成纖維細胞無著色)。光鏡下觀察結果,每片觀察5個高倍視野(×200倍),計數(shù)100個細胞。無論著色是淡黃色、棕黃色還是黃褐色,計數(shù)腫瘤細胞中呈部分或者完整的胞膜著色的陽性百分比<5%為陰性,≥5%為陽性[5]。

1.3.2EGFR基因突變檢測 (1)將患者的肺癌組織蠟塊,對照HE切片用金剛石刻字筆劃出腫瘤區(qū)域,連續(xù)切5～10張4 μm切片,除去非腫瘤組織,將蠟片放入1.5 mL離心管(EP管)中,蓋好管蓋,做好標記。在樣本制備區(qū)生物安全柜內(nèi),按凱杰公司(Qiagen)的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織DNA抽提試劑盒說明書(56404)提取腫瘤組織DNA。提取完畢,立即用超微分光光度計檢測DNA的濃度和純度,確保達到質(zhì)控標準(A260/A280∶1.8～2.0)。按試劑盒說明書用雙蒸水稀釋樣本DNA濃度至2 ng/μL,吸取42.3 μL DNA,加入2.7 μL TaqDNA聚合酶,震蕩混勻后瞬時離心；將混合好的DNA、酶混合物依次吸取5.0 μL，沿著上管壁加入8聯(lián)管反應條(反應條中的試劑包括引物、探針、dNTPs、Buffer)中，蓋好管蓋，離心15 s。(2)將8連管反應條通過傳遞窗移入PCR擴增區(qū),上機擴增。PCR程序為第1階段:95 ℃ 5 min,1個循環(huán);第2階段:95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環(huán);第3階段:93 ℃25 s,60 ℃ 35 s(收集FAM和VIC熒光信號),72 ℃ 20 s,31個循環(huán)。檢測完畢取出反應條,用一次性手套包好扔進垃圾桶,保存實驗結果,按說明書判讀結果。(3)每個樣本的檢測條為8個孔。 1～7號孔分別檢測Exon18 G719X(G719A、G719S、G719C)、Exon19 Del(19種)、Exon20 T790M、Exon20 S768I、Exon20 Ins、Exon21 L858R、Exon21 L861Q位點,8號孔為DNA質(zhì)控孔。外控由FAM信號指示,內(nèi)控由VIC信號指示,每次實驗均設陰、陽性對照。

1.4統(tǒng)計學處理 將數(shù)據(jù)導入SPSS15.0和Stata 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗;采用Logistic回歸模型分析EGFR基因突變狀態(tài)的危險因素比值比(OR);采用Spearman等級相關分析PD-L1蛋白表達與 EGFR基因突變狀態(tài)的相關性。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1PD-L1蛋白與患者臨床病理特征的關系 PD-L1蛋白表達以腫瘤細胞完整或部分薄膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,著色深淺不一，見圖1。巨噬細胞浸潤時也會有陽性表達,可以作為陽性內(nèi)對照。本研究中93例肺癌組織中有52例觀察到PD-L1蛋白表達的陽性信號(55.9%，52/93),而癌旁組織中完全無PD-L1蛋白表達。同時,PD-L1蛋白表達與TNM分期相關,在不同TNM分期的NSCLC表達存在明顯差別,其中TNMⅡ(83.3%，15/18)、Ⅲ期(57.1%，8/14)肺癌的陽性率顯著高于Ⅰ期(47.5%，29/61),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、吸煙史、病變部位、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、組織學類型及分化類型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

注：A表示肺腺癌石蠟組織HE染色;B表示肺鱗癌石蠟組織HE染色;C表示PD-L1(28-8)蛋白在肺腺癌中的陽性表達(En Vision兩步法);D表示PD-L1(28-8)蛋白在肺鱗癌中的陽性表達(×200,En Vision兩步法)

圖1 PD-L1(28-8)蛋白在NSCLC中的表達

表1 PD-L1蛋白表達、 EGFR基因突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關系

2.2EGFR突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關系 93例NSCLC中EGFR突變型46例,野生型47例,突變率為49.5%,其中包含Exon19 Del突變19例，Exon21 L858R突變26例，Exon20 S768I突變1例，Exon20 T790突變1例，Exon20 Ins突變3例，Exon19 Del、Exon20 T790雙突變1例。由于Exon20 T790M和Exon20 Ins為酪氨酸激酶抑制劑(TKI)耐藥位點,這5例耐藥位點突變占總例數(shù)的5.37%,提示患者可能對1代TKI耐藥,含有T790 M突變的患者可以使用3代TKI抑制劑奧希替尼(AZD9291)。為便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,將包含這2個位點的突變組和無突變組合并為野生型組。由表2可以看出,EGFR突變狀態(tài)與患者的性別、吸煙史、腫瘤大小和組織學類型相關,女性患者的突變率(73.8%，31/42)顯著高于男性患者(29.4%，15/51)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);無吸煙史(61.7%，37/60)、腫瘤大小≤3 cm(57.6%，34/59)、腺癌(54.9%，45/82)的患者突變率高于有吸煙史(27.3%，9/33)、腫瘤大小>3 cm(35.3%，12/34)、鱗癌(9.09%，1/11)的患者(P<0.05);而與患者年齡、病變部位、淋巴結轉(zhuǎn)移、分化類型和臨床分期無關(P>0.05)。

為進一步分析影響EGFR基因突變狀態(tài)的獨立因素,通過Logistic回歸模型對EGFR基因突變狀態(tài)進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，在控制性別、吸煙史、腫瘤大小和組織學類型后,患者性別可顯著影響EGFR基因突變狀態(tài)(P<0.05),而吸煙狀態(tài)、腫瘤大小和組織學類型與EGFR基因突變狀態(tài)無相關性(P>0.05)。 見表2。

表2 EGFR基因突變預測的多因素分析

2.3PD-L1蛋白表達與EGFR基因突變狀態(tài)的相關性 Spearman 等級相關分析顯示,PD-L1蛋白表達與EGFR基因突變狀態(tài)無相關性(r=-0.161,P>0.05)，見表3。

表3 PD-L1蛋白表達與 EGFR基因突變狀態(tài)的相關性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與人類免疫系統(tǒng)關系密切。正常情況下,免疫系統(tǒng)會通過T細胞殺傷腫瘤細胞,T細胞過度激活會引起炎癥損傷，誤傷正常細胞等[6]。T細胞通過免疫檢查點抑制劑保護免疫系統(tǒng),類似“剎車”的作用,而這一特點也會被腫瘤細胞所利用,抑制免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫功能。免疫檢查點抑制劑是指共同抑制T淋巴細胞信號通路的分子,包含細胞毒性T細胞(CTL)、PD-1及其配體PD-L1等[6-7]。當T細胞表面的PD-1蛋白與腫瘤細胞表面的PD-L1蛋白結合時,PD-1/PD-L1信號通路被激活,戴上面具的PD-L1蛋白的腫瘤細胞和正常細胞混在一起,躲避CTL的識別和攻擊,從而在人體內(nèi)繁衍生息[7-8]，這提示PD-1/PD-L1結合可能在抗腫瘤免疫過程中參與了免疫逃逸,發(fā)揮負調(diào)控作用?？茖W家們由此獲得啟發(fā),只要能阻斷二者的結合,就能充分激活T細胞,重新識別和殺傷腫瘤細胞,起到抗腫瘤的作用?；谶@一特性,研究者研發(fā)了2種人源性單克隆抗體PD-1、PD-L1,用來阻止PD-1/PD-L1結合,從而使機體恢復腫瘤免疫功能。目前,封鎖免疫檢查點PD-1/PD-L1的腫瘤免疫靶向療法,在NSCLC、惡性黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胃癌、腎細胞癌等多種類型腫瘤患者的治療中取得卓越的療效[4]。隨著國內(nèi)首個PD-1抑制劑歐狄沃(納武利尤單抗注射液)被批準上市,中國正式開啟免疫治療時代。

關于PD-L1蛋白在NSCLC的表達及其與臨床病理特征的關系的研究結果截然不同[9-12]。來自中國臺灣的YANG等[9]報道PD-L1表達的陽性率為39.9%,在高分化腫瘤中的陽性率較高;來自韓國首爾CHA等[10]報道,323例肺癌中有60例(18.6%)PD-L1表達陽性,以前或現(xiàn)在的吸煙者中較高的PD-L1表達(≥50%)更為普遍,并且與吸煙者年齡增加相關;來自日本福岡的TAKADA等[11]采用免疫組織化學檢測497例肺腺癌組織中PD-L1蛋白的表達,臨界值為5%時的陽性率為20.4%(85例),臨界值為1%時的陽性率為43.5%(144例),PD-L1蛋白傾向于在男性、吸煙者、高級別臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移中高表達。本研究中PD-L1蛋白表達的陽性率為55.9%,這與來自韓國首爾的KOH等[12]研究結果接近;PD-L1蛋白表達與TNM分期相關,TNMⅡ(83.3%)、Ⅲ期(57.1%)肺癌的陽性率顯著高于Ⅰ期(47.5%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),這與TAKADA等[11]的研究一致;而PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、吸煙史、病變部位、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、組織學類型及分化類型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這可能是由于種族、組織學類型、臨床分期、樣本量大小的差異造成的。此外,目前檢測PD-L1蛋白的生產(chǎn)廠家、克隆號、配套的檢測儀器、檢測條件、判讀時的臨界值尚無統(tǒng)一標準也會得出不同的結果。

EGFR基因位于人類7號染色體，包含28個外顯子，其酪氨酸激酶編碼區(qū)為18～24號外顯子。EGFR定位于細胞膜，通過RAS/RAF/MEK/MAPK、PI3K/AKT/mTOR途徑傳進細胞核。當該通路的信號傳導異常時，EGFR突變引發(fā)其自身磷酸化,激活酪氨酸激酶，并進一步激活下游信號通路，促進腫瘤的發(fā)生。NSCLC中19號外顯子缺失和21號外顯子L858R點突變是目前最常見的突變方式[13]。與傳統(tǒng)的化療相比，口服TKI毒性更低，能顯著改善患者的生活質(zhì)量，延長患者生存期，治療效果更持久[14]。DEARDEN等[15]報道亞洲NSCLC患者EGFR突變率為47.9%。THATCHER等[16]首次報道EGFR基因突變率在女性、無吸煙史、腺癌或東亞患者中更高，此類人群更易從EGFR-TKI治療中獲益。而隨后SHI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變的獨立影響因素為吸煙史、病理類型。本研究93例NSCLC中EGFR突變率為49.5%,這與DEARDEN等[15]的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，女性(73.8%)、無吸煙史(61.7%)、腫瘤大小≤3 cm(57.6%)、腺癌(454.9%)的患者突變率高于男性(29.4%)、有吸煙史(27.3%)、腫瘤大小>3 cm(35.3%)、鱗癌(9.09%)的患者(P<0.05);而與患者年齡、病變部位、淋巴結轉(zhuǎn)移、分化類型和臨床分期無關(P>0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者性別可獨立影響EGFR基因突變狀態(tài)(P<0.05),這與SHI等[17]研究結果不一致,可能原因是樣本人群來源地區(qū)的差異、回顧性樣本選擇的偏倚和不同檢測方法的靈敏度不同。

關于PD-L1蛋白表達與EGFR基因突變狀態(tài)的關系,目前尚不清楚,仍是當前的研究熱點。本研究通過Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn),PD-L1蛋白表達與EGFR基因突變狀態(tài)無相關性(P>0.05),這與YANG等[4]報道一致;而TAKADA等[11]報道PD-L1蛋白傾向于在EGFR野生型中高表達;AZUMA等[18]發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達在EGFR突變型中要顯著高于EGFR野生型。

鑒于目前PD-L1檢測標準和判讀標準不統(tǒng)一，本研究使用的PD-L1抗體克隆號為28-8，在未來的研究中可以使用其他一些克隆號，如22C3、SP142、SP263等進一步深入研究。此外，除了在蛋白水平運用免疫組織化學檢測PD-L1，已有文獻報道在多種癌癥中通過外周血中循環(huán)腫瘤RNA檢測PD-L1基因的表達水平[19]，隨著2代測序技術的不斷發(fā)展和普及，以后可以通過檢測腫瘤突變負荷更高效地篩選免疫治療患者，在基因水平以更好地指導患者用藥。

4 結 論

檢測PD-L1蛋白表達、EGFR基因突變狀態(tài)有助于高效篩選免疫治療和靶向治療的檢測對象,為臨床用藥提供理論依據(jù)。