秦緒偉 王景偉 張丹

水貂腦炎鏈球菌的分離鑒定與藥敏試驗

秦緒偉 王景偉 張丹

（齊魯動物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

本試驗對山東日照某水貂養(yǎng)殖場的水貂死亡病例進(jìn)行了臨床判斷，經(jīng)實驗室的染色鏡檢、細(xì)菌分離、生化試驗確診為鏈球菌。經(jīng)藥敏試驗，選擇敏感性高的藥物進(jìn)行治療，最終控制了病情。

水貂 腦炎 鏈球菌 鑒定 藥敏

鏈球菌在自然條件下廣泛存在，是一種人獸共患傳染病病原[1]，可以感染多種毛皮動物和家畜[2]，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的急性敗血性疾病。水貂鏈球菌病多散發(fā)或者地方性流行[3]，臨床癥狀為頭頸部的腫脹，尖叫、搖頭晃腦。病原為C型獸疫鏈球菌，可以通過呼吸道和消化道傳播[1]。鏈球菌環(huán)境中常存在，各種動物在應(yīng)激條件下容易患病，一年四季都有發(fā)生，但是在炎熱的夏季發(fā)病最多，特別是水貂分窩前后，發(fā)生較多，成為養(yǎng)殖場防不勝防的疾病。傳染源主要是被污染的籠子、用具、墊草等[4]。

2019年6月，山東某水貂養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖水貂4000只，60日齡左右，大群精神良好、食欲、飲欲正常，發(fā)病呈現(xiàn)散發(fā)癥狀，有的搖頭晃腦、尖叫，嚴(yán)重的吃食困難，慢慢消耗，有的癱瘓、急性死亡。養(yǎng)殖場自行投藥復(fù)合維生素B、葡萄糖3d，效果不佳，發(fā)病持續(xù)增加，從每天發(fā)現(xiàn)1~2只，慢慢發(fā)展每天5~7只，畜主帶病貂來實驗室化驗，經(jīng)臨床診斷、實驗室的分離培養(yǎng)鑒定為鏈球菌，經(jīng)藥敏試驗，最終控制了病情。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株 山東日照一養(yǎng)殖場，發(fā)生水貂搖頭晃腦的癥狀，畜主帶2只病貂到實驗室請求化驗，經(jīng)實驗室的化驗，無菌從腦分離到一株細(xì)菌，作為試驗菌株。

1.2 器材 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏DNP-9162型；潔凈工作臺，蘇州安泰SW-CJ-2FD型；生物顯微鏡，奧林巴斯CX-31型；電磁爐，半球電器；立式蒸汽滅菌器，上海申安LDZX-75KBS型；細(xì)菌微量生化反應(yīng)小管，購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、皰肉培養(yǎng)基，購自青島海博試劑公司；藥敏片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；牛血清，購自山東勁牛生物科技股份試劑公司；犬瘟熱、細(xì)小病毒試紙，購自韓國安捷。其他實驗室常用器具：解剖臺、解剖剪、手術(shù)刀、酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)皿等。小白鼠，購自山東大學(xué)試驗動物中心；水貂，購自山東旭升養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.3 細(xì)菌分離 無菌條件下開啟水貂的腦顱，將腦進(jìn)行觸片，革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢。無菌取肝臟、腦組織、心血進(jìn)行細(xì)菌分離，接種血清瓊脂平板、巧克力瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌細(xì)菌生長情況，若有細(xì)菌生長，涂片鏡檢。無菌取肝臟、腦組織，接種厭氣肉干湯培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)18h，觀察有無氣泡產(chǎn)生。

1.4 病毒檢測 取眼、鼻內(nèi)容物，按說明處理，滴加到犬瘟熱試紙；取肛拭子，按說明處理，滴加到細(xì)小病毒試紙，靜止3min后，觀察檢測結(jié)果。無菌取腦、脾臟、淋巴結(jié)1:10加生理鹽水研磨，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，檢測犬瘟熱、細(xì)小病毒、阿留申病毒。

1.5 生化試驗[5]無菌取腦部組織進(jìn)行細(xì)菌分離，接種血清平板，根據(jù)不同說明要求37℃溫箱培養(yǎng)18~72h，取血清平板分離的細(xì)菌，接種加2%血清馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，接種后18h取樣0.2ml培養(yǎng)液，接種微量生化反應(yīng)小管葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉實糖、水楊苷、山梨醇、甘露糖、菊糖等，進(jìn)行觸酶試驗。

1.6 16S rRNA 取馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)的分離菌，使用裂解法進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取，細(xì)菌適量放入1.5ml離心管，12000r/min離心1min，去掉上清液，使用無菌水重懸，搖勻后沸水7min，再冰浴5min，上清作為基因模板。設(shè)計引物，基因擴(kuò)增16S rRNA，PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物送交測序。根據(jù)測序結(jié)果，與Genbank進(jìn)行對比，16S rRNA以相似性97%以上為界限確定為何種細(xì)菌。

1.7 溶血性鑒定 無菌取腦部組織接種2%血清平板培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種鮮血瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察菌落周邊情況。

1.8 藥敏試驗 取血清平板分離的腦部細(xì)菌菌落，均勻地涂布在營養(yǎng)血清平板，將不同的藥敏片貼于平板上，溫箱37℃培養(yǎng)24h，觀察記錄不同藥物敏感程度結(jié)果。

1.9 毒力試驗 取血清平板分離的腦部細(xì)菌，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，接種后在溫箱37℃培養(yǎng)18h，腹腔接種16~18g小白鼠5只，0.5ml/只，同時設(shè)空白對照不接種小鼠3只，接種后觀察7d，記錄小鼠死亡情況。腹腔接種2月齡水貂3只，2ml/只，觀察有無癱瘓、搖頭等神經(jīng)癥狀，同時設(shè)空白對照不接種水貂2只，接種后觀察15d，觀察記錄水貂發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果 無菌取水貂腦部組織，在載玻片上觸片，革蘭氏染色，鏡檢可見陽性球菌，單個或者幾個排列。取心血、肝臟、腦組織，接種培養(yǎng)基后，37℃溫箱培養(yǎng)24h，可見血清瓊脂平板、巧克力瓊脂有露珠樣透明小菌落，SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板不生長。血清平板和巧克力平板細(xì)菌顯微鏡鏡檢，可見革蘭氏陽性球菌。

2.2 病毒檢測結(jié)果 犬瘟熱試紙、細(xì)小病毒試紙，檢測結(jié)果都為陰性。無菌取腦組織、肝臟按照1:10加PBS研磨，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，檢測犬瘟熱、細(xì)小病毒、阿留申病毒陰性。

2.3 生化試驗結(jié)果 分離的細(xì)菌發(fā)酵分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉實糖、水楊苷，不分解山梨醇、甘露糖、菊糖，觸酶試驗陰性(見表1)。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.4 16S rRNA結(jié)果 裂解法提取細(xì)菌總DNA，把PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序，測序后進(jìn)行基因比對，最終確定分離菌為2型鏈球菌。

2.5 溶血性鑒定結(jié)果 無菌取腦部組織接種2%血清平板培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種鮮血瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察平板明顯的細(xì)小露珠樣菌落，周邊有明顯的溶血環(huán)，屬于乙型溶血。

2.6 藥敏試驗結(jié)果 使用藥敏紙片法對分離菌進(jìn)行藥敏實驗，經(jīng)檢測頭孢喹肟、阿莫西林、頭孢噻呋、丁胺卡那霉素高敏，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星低敏，強力霉素、粘桿菌素、氟苯尼考、壯觀霉素不敏感(見表2)。

表2 分離菌的藥敏結(jié)果 (mm)

2.7 毒力試驗結(jié)果 分離的細(xì)菌，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)后，腹腔接種16~18g小白鼠5只，3~4日全部發(fā)病死亡，對照組觀察7日正常健活。腹腔接種2月齡水貂3只，4~7d可見癱瘓、搖頭、尖叫等神經(jīng)癥狀，對照組觀察15d正常健活。

3 討論

（1）鏈球菌種類很多，自然界存在于水、土壤、塵埃、動物體表、消化道、生殖黏膜、乳汁等[6]，有的是動物體內(nèi)正常的菌群，有的是致病性菌，惡劣條件會促進(jìn)疾病的發(fā)生，可以引起化膿、肺炎、腦炎等疾病。毛皮動物的鏈球菌性腦炎主要是溶血性鏈球菌感染分窩斷奶期水貂、狐貍，其他生長期間水貂、狐貍散發(fā)，很少有群發(fā)或者大規(guī)模爆發(fā)的病例。（2）水貂鏈球菌性腦炎，常見于斷奶期水貂，主要是由溶血性鏈球菌感染，引起水貂的急性死亡，尖叫、癱瘓、搖頭晃腦，慢性病例也因為癱瘓或者頭部搖晃無法進(jìn)食而死亡。發(fā)生水貂的癱瘓、尖叫病例，可以初步診斷為水貂腦炎，但是病毒、細(xì)菌、維生素缺乏、寄生蟲都可以水貂腦炎，需要進(jìn)行具體鑒別診斷。病毒性腦炎多爆發(fā)或者大規(guī)模群發(fā)，難以治療，病毒分離或者基因檢測可以診斷；細(xì)菌性腦炎，多散發(fā)，臨床癥狀明顯，藥物治療有效果，細(xì)菌分離或者鏡檢基本可以診斷；維生素缺乏性腦炎，主要是VB1缺乏，個別發(fā)生，不死亡，癱瘓后飲食障礙，最后消瘦死亡；寄生蟲性腦炎，發(fā)生較少，主要發(fā)生于飼喂淡水魚的養(yǎng)殖場，未煮熟，感染寄生蟲，侵害腦部引發(fā)腦炎。發(fā)生腦炎疾病，可以根據(jù)臨床癥狀初步診斷，或者藥物治療性診斷，一般可以診斷，具體確診需要實驗室的檢測。（3）水貂發(fā)生疾病，及時進(jìn)行實驗室診斷，確診后注意環(huán)境消毒，飼料飲水衛(wèi)生，選擇敏感性高的藥物及時治療，綜合治理。此次病例，零散發(fā)生，臨床初步診斷腦炎，經(jīng)實驗室的細(xì)菌分離鑒定，最終確定為鏈球菌感染，經(jīng)藥敏試驗，結(jié)合臨床實際，全群投藥口服阿莫西林和卡巴匹林鈣，發(fā)病水貂注射頭孢喹肟和氟尼辛譜甲胺，3d后發(fā)病穩(wěn)定，7d后全群正常。

[1] 夏咸柱. 野生動物疫病學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011, 724-729.

[2] 錢愛東. 獸醫(yī)全攻略-毛皮動物疾病[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009, 304-308.

[3] 閆新華. 毛皮動物疾病診療原色圖譜[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2008, 64.

[4] 孫衛(wèi)東. 貂病診療與處方手冊[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008, 58-59.

[5] 周庭銀. 臨床微生物學(xué)診斷與圖解(第2版)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006, 97-98.

[6] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)(第5版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013, 204-212.

（2019–08–03）

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