帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，其病因尚未完全明確，研究表明，免疫/炎癥機制參與了PD的發(fā)病[1]。小膠質細胞是腦內主要的免疫/炎癥細胞，小膠質細胞的激活，是PD等神經退行性疾病的共同病理生理機制。黑質部位小膠質細胞的數量是腦內其他部位的4.5倍，因此該部位對炎癥刺激更為敏感，一旦小膠質細胞的過度激活呈慢性、持續(xù)性狀態(tài)，就會分泌出大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-β(IL-β)、一氧化氮(NO)等，最終導致該部位多巴胺神經元細胞嚴重受損甚至死亡[1]。受傷的神經元細胞同時還生成一些物質，如α-突觸核蛋白(α-synuclein)[2]，其病理性蓄積的發(fā)生早于多巴胺神經元的死亡，而細胞自噬功能障礙是導致α-synuclein清除障礙和異常積聚的重要因素[3-4]。隨著對自噬應激認識的深入，日益認識到單純的自噬激活并不能對α-synuclein 病理性蓄積引起的多巴胺能神經元死亡發(fā)揮保護作用，若自噬誘導與自噬降解之間失平衡反而可能會加劇神經元損傷。

四環(huán)素類抗生素是一類廣譜堿性抗生素，其半合成有多西環(huán)素和米諾環(huán)素(minocyclein)等。早已有研究發(fā)現，米諾環(huán)素能通過血腦屏障，在腦脊液和中樞神經系統(tǒng)中有很高的血藥濃度，且具有顯著的神經保護作用[5]。目前對米諾環(huán)素的神經保護研究主要集中在神經炎癥的調控和神經元凋亡這兩方面[6]，有關α-synuclein降解和自噬/溶酶體方面尚無深入研究。動物模型研究證實，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)單次腹腔注射能引起黑質部位急性炎癥反應，小膠質細胞持續(xù)活化，出現慢性、進行性加重PD樣的病理改變[7]。本研究利用這一PD模型，就米諾環(huán)素對黑質急性炎癥、α-synuclein降解和自噬功能障礙的影響進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL 3月齡雄性小鼠，體質量250～280 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[許可證號：SCXK(滬)2003-0003]。小鼠在SPF級動物房飼養(yǎng)[SYXK(蘇)2005-0001]。飼養(yǎng)密度4只/盒，溫度(24±1) ℃，相對濕度(70±4)%，自由攝食與飲水，自動光控12 h明暗周期。

1.2 藥品與試劑 LPS、米諾環(huán)素、兔抗α-synuclein抗體購自Sigma 公司；羊抗Iba-1抗體、兔抗LC3抗體購自Abcam 公司；兔抗HDAC6抗體購自Bioworld 公司；兔抗p62抗體購自ZNEO公司；小鼠單克隆β-actin抗體購自Santa Cruz公司；Western及IP細胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；普通二抗購自Jackson ImmunoResearch公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 動物的分組和給藥 所有小鼠被隨機分為7組：(1)對照組；(2)單獨LPS組；(3)75 mg M+LPS組；(4)50 mg M+LPS組；(5)25 mg M+LPS組；(6)單獨75 mg M組；(7)單獨 50 mg M組(75 mg M、50 mg M、25 mg M分別代表75 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg米諾環(huán)素)。單獨或聯合使用米諾環(huán)素干預的組別按對應的米諾環(huán)素劑量連續(xù)給藥3次，分別為LPS注射前2 d、1 d和1 h；對照組和單獨LPS組給予50 mg/kg生理鹽水注射。所有LPS處理組小鼠單次腹腔注射LPS 5 mg/kg，對照組和單獨米諾環(huán)素組小鼠給予同等劑量的生理鹽水。

1.4 行為學測試 分別在LPS注射前1 d、注射后1 d對各組動物進行行為學測試。每次測試的順序是隨機的，檢測時間均選在開始光照后的2 h。所有行為學檢測均在一恒溫、固定布局、安靜并光照充分的房間進行，固定由2名實驗者進行，一人負責儀器操作，另一人負責記錄。

爬桿試驗：爬桿時間是反映小鼠運動功能的良好行為學指標，能綜合評價動物運動能力。自制小鼠爬桿，為一根豎直圓桿，直徑8 mm，高度70 cm，表面纏敷醫(yī)用膠布以防滑，并標有刻度。測試前引導、訓練小鼠從桿頂向下爬至桿底平面2次，測試時將小鼠頭端向下置于桿頂，記錄小鼠從50 cm高度爬至桿底平面的時間作為小鼠爬桿所需時間，每只小鼠測3次，每次間隔5 min。小鼠中途如出現調頭、停滯不前或直接躍下均視為無效結果，需重新測試。

1.5 免疫組化法觀察小膠質細胞變化 脫頸法迅速斷頭取腦，并切取黑質相應區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma-3.8)組織，以SP法行免疫組織化學檢測，滴加所需的一抗(Iba-1為1：100)，空白對照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗，置4℃冰箱過夜后滴加二抗，DAB顯色劑顯色，適時終止顯色反應，封固。光鏡下計數所有包含黑質區(qū)域的切片中Iba-1陽性細胞的個數，累計每例所有切片計數之和，并觀察形態(tài)學變化。

1.6 免疫印跡法測定自噬相關蛋白含量 脫頸法迅速斷頭取腦,并切取黑質相應區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma -3.8)組織存于-80 ℃冰箱，選取腹側中腦相應黑質部位的組織，按10 mg/mL加入裂解液制成勻漿，冰浴靜置30 min，離心取上清總蛋白質，以磷酸緩沖鹽溶液將各樣品蛋白稀釋至相同濃度后，采用免疫印跡法(Western blot法)測定α-synuclein和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、p62和HDAC6蛋白表達量。

2 結果

2.1 行為學結果 LPS注射后1 d與對照組相比，LPS處理組小鼠爬桿速度減慢(P<0.01)；其中，與單獨LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠爬桿速度進一步減慢(P<0.05)，而25 mg M+LPS組及50 mg M+LPS組爬桿速度較LPS組則顯著提高(P<0.01)；與此同時，單獨米諾環(huán)素組(包括75 mg M組和50 mg M組)爬桿速度較對照組無顯著變化(P>0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，**P<0.01；與單獨LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖1 小鼠爬桿速度變化(n=10)

2.2 LPS注射后1 d各組小鼠黑質部位炎癥反應變化 與對照組相比，LPS處理組小鼠黑質部位出現大量活化的小膠質細胞，單獨米諾環(huán)素(包括75 mg M和50 mg M)組小鼠黑質部位也出現極少量活化的小膠質細胞。與LPS組相比，25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組小鼠黑質部位活化的小膠質細胞數量均有所減少，而75 mg M+LPS組小鼠黑質部位活化的小膠質細胞數量有所增加。見圖2。

2.3 黑質部位α-synuclein蛋白水平變化 與對照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.01)，25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組無明顯變化(P>0.05)；75 mg M及50 mg M組小鼠黑質部位α-synuclein蛋白水平與對照組相比，差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠黑質部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質部位α-synuclein蛋白水平則較LPS組明顯下降(P<0.01)。見圖3。

2.4 黑質部位自噬相關蛋白表達

2.4.1 LC3-Ⅱ蛋白表達水平變化：與對照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質部位LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著提高，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠的LC3-Ⅱ蛋白表達水平也提高(P<0.001)，75 mg M組小鼠黑質部位LC3-Ⅱ蛋白水平也出現少量增加(P<0.05)，50 mg M組無明顯變化(P>0.05)。與LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠黑質部位LC3-Ⅱ蛋白表達水平進一步增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質部位LC3-Ⅱ蛋白水平顯著下降(P<0.01)。見圖4。

圖2 小鼠黑質部位小膠質細胞(Iba-1)，30 μm

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖3 小鼠黑質部位α-synuclein蛋白表達變化(n=4)

注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖4 小鼠黑質部位LC3-Ⅱ蛋白表達變化(n=4)

2.4.2 p62蛋白表達水平變化：與對照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質部位p62蛋白水平顯著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠無明顯變化(P>0.05)；與LPS組相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質部位p62蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見圖5。

2.4.3 HDAC6蛋白表達水平變化：與對照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質部位HDAC6蛋白水平顯著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠輕度增加(P<0.01)；與LPS組相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質部位HDAC6蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見圖6。

3 結論

注：與對照組比較，***P<0.001；與LPS組比較， ###P<0.001圖5 小鼠黑質部位p62蛋白表達變化(n=4)

注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與LPS組比較，###P<0.001圖6 小鼠黑質部位HDAC6蛋白表達變化(n=4)

目前PD的病因尚不明確，黑質多巴胺能神經元變性壞死和α-synuclein的異常積聚是PD的主要病理特征。神經炎癥是所有神經退行性疾病的共同病理機制，受損神經元和炎癥反應之間存在著自我推進式的惡性循環(huán)，任何能打破該惡性循環(huán)的治療都應該可以延緩該類神經疾病的進展?；驅W分析提示，許多炎癥因子的DNA多態(tài)性是PD的危險因素[8]；抗炎藥物能降低小膠質細胞的活性，減少促炎癥因子的分泌，各國學者紛紛致力于尋找合適的藥物調控促炎因子的生成，從而在神經退行性疾病的治療中發(fā)揮神經保護作用[5,7]。

本研究表明，25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預能明顯改善PD模型小鼠的急性運動障礙，減輕黑質部位的急性炎癥反應，在一定程度上打破黑質部位受損多巴胺神經元和炎癥反應之間自我推進式的惡性循環(huán)，有可能延緩多巴胺神經元的進行性缺失。PD的發(fā)病與多種機制有關，其中α-synuclein清除受損和自噬功能障礙是其中重要的一環(huán)。分泌至胞外的α-synuclein不僅會造成周圍神經元的損傷[9]，還可以激活周圍膠質細胞導致神經炎癥的發(fā)生[10]。因此，能夠激活自噬的藥物可通過促進α-synuclein清除來延緩疾病進展[11]。本研究在證實了米諾環(huán)素的抗炎癥作用同時，研究了小鼠黑質部位α-synuclein蛋白水平變化，發(fā)現25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素的預處理亦能緩解PD小鼠黑質部位α-synuclein的異常聚集。因此，筆者有理由推測米諾環(huán)素可能通過減少α-synuclein的積聚而延緩PD的進程。

細胞自噬普遍存在于真核細胞中，是細胞通過自身形成的囊泡，吞噬胞漿內變性蛋白質和細胞器，維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程[12]。在病理狀態(tài)或老化狀態(tài)下，將出現自噬激活和降解兩者間的失衡，導致錯誤折疊蛋白在體內的積聚，細胞自噬功能障礙參與了PD的發(fā)生。研究表明，四環(huán)素類抗生素米諾環(huán)素和替加環(huán)素具有誘導自噬的功能[13-14]，米諾環(huán)素可以通過AMPKα1信號介導的自噬抑制輻射誘導神經元凋亡[15]。有研究者在PD病人的大腦黑質中檢測到了空泡樣的自噬體，并且觀察到了LC3-Ⅱ的表達上調[16]。自噬的激活可能是有利于神經元存活的保護性反應，但是過度激活將導致神經元的死亡[17-18]。自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、HDAC6和p62三者與自噬的發(fā)生密切相關，本研究發(fā)現25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預組PD小鼠黑質部位LC3-Ⅱ、HDAC6蛋白表達下降，自噬底物p62蛋白的表達量也出現同步下降，結合上述對實驗小鼠相同部位α-synuclein蛋白表達量的檢測結果分析，可以合理推測PD模型小鼠黑質部位的自噬應激在25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素預干預下有所緩解，自噬激活和降解間的失衡有所好轉。

本研究結果顯示，75 mg M+LPS米諾環(huán)素干預組中LC3-Ⅱ、HDAC6的蛋白表達量較單獨LPS組進一步增加，而且自噬產物p62和α-synuclein的水平也出現同步增加。與此同時，單獨75 mg/kg米諾環(huán)素組實驗小鼠黑質部位的LC3-Ⅱ蛋白表達水平較對照組也有所增加，這一結果提示，高劑量的米諾環(huán)素可能存在某種機制導致自噬的過度激活，需要在后期的實驗中繼續(xù)觀察及深入研究。另一方面也提示，單純激活自噬很可能是無效的，甚至是有害的，維持自噬激活和底物降解之間的平衡，促進底物的降解可能具有更好的神經保護作用。

綜上所述，低、中劑量的米諾環(huán)素可保護LPS所致的小鼠黑質多巴胺能神經元損傷，減輕系統(tǒng)性炎癥所致黑質部位的急性炎癥反應，平衡過度激活的自噬功能，促進α-synuclein自噬性清除可能是其有效的作用機制。因此，米諾環(huán)素是PD治療的一個非常有潛力的靶點藥物，其在臨床應用中的可行性、有效性和安全性等問題則需要更多及更深入的研究。