呂春榮，李俊喜，Allai Larbi，權(quán)國(guó)波*

（1.云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，云南省肉羊工程技術(shù)研究中心，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2.祿豐縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南祿豐 651200）

精液冷凍保存對(duì)于山羊種質(zhì)資源保護(hù)和人工授精技術(shù)推廣具有非常重要的意義。眾所周知，精子在冷凍過(guò)程中要面臨冰晶機(jī)械損傷、低溫沖擊、滲透和化學(xué)毒性損傷、氧化損傷等問(wèn)題，因此影響凍精質(zhì)量的因素復(fù)雜，目前精子冷凍損傷機(jī)制尚不清楚。但普遍認(rèn)為冷凍保存過(guò)程中冰晶的形成及氧化應(yīng)激，特別是過(guò)量活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生，是導(dǎo)致凍精質(zhì)量下降的主要原因之一。ROS 在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[1]，但超過(guò)生理水平的過(guò)量ROS 直接導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[2]，尤其是不飽和脂肪酸含量豐富的精子質(zhì)膜更容易被ROS 攻擊，造成過(guò)氧化損傷[3]。據(jù)報(bào)道，在稀釋液中添加外源抗氧化劑可改善牛[4]、馬[5]和山羊[6-7]精子冷凍解凍后的質(zhì)量。

白藜蘆醇早在1924 年就被發(fā)現(xiàn)，1974 年在葡萄屬植物中找到該物質(zhì)，并首先定性為是一種能自身產(chǎn)生抗逆性的物質(zhì)[8]。白藜蘆醇是一種天然的非黃酮類多酚類復(fù)合物，在抗炎、抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)氧化還原信號(hào)等方面發(fā)揮重要作用，并可作為自由基的有效清除劑[9]。研究表明白藜蘆醇可以顯著提高家畜凍精品質(zhì)[4-5,10-11]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究白藜蘆醇緩解山羊精子冷凍解凍過(guò)程中冷凍損傷的作用，進(jìn)而改善山羊凍精的品質(zhì)，為山羊凍精人工授精技術(shù)的推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma 公司。Optidyl 牛用稀釋液購(gòu)自法國(guó)IMV公司，Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 精液的采集及處理

1.2.1 精液采集和處理 精液采自昆明易興恒畜牧科技有限責(zé)任公司8 只健康、成年（2～3 歲）云上黑山羊種公羊。采集好的精液馬上進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，只有精液量為1～2 mL，最低精子密度達(dá)2.5×109/mL，精子活力在75%以上的精液才能用于冷凍保存。將符合標(biāo)準(zhǔn)的精液混勻后分為5 等份，與含不同濃度白藜蘆醇（0、0.1、1、10、20 μmol/L）的稀釋液混合均勻，最終調(diào)整精子密度為2×108/mL，其中不添加白藜蘆醇為對(duì)照組。

1.2.2 冷凍和解凍 將稀釋后的精液在冷庫(kù)中平衡至5℃，然后將精液分裝在冷凍細(xì)管中，在液氮蒸氣中預(yù)凍10 min，預(yù)凍后直接將冷凍細(xì)管投入液氮中保存30 d。解凍時(shí)，細(xì)管在37℃水浴30 s 即可。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 活力 用SCA 精液分析儀（Version 5.1；Microptic，Barcelona，Spain）檢測(cè)精子總活力和直線運(yùn)動(dòng)百分率，每組至少分析500 個(gè)精子，具體操作參見(jiàn)儀器操作說(shuō)明。

1.3.2 質(zhì)膜完整性檢測(cè) 采用低滲耐受性試驗(yàn)（HOST）檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性。低滲溶液的配制：精確稱取9 g 果糖和4.9 g 檸檬酸鈉溶于1 000 mL 滅菌水。100 μL 低滲溶液中緩慢加入10 μL 精液混勻后在37℃水浴中孵育30 min。涂片在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)發(fā)生彎尾的精子數(shù)（圖1）。精子質(zhì)膜完整性=彎尾的精子數(shù)/400×100%。

圖1 精子HOST 檢測(cè)

1.3.3 頂體完整性檢測(cè) 用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的豌豆凝集素（FITC-PSA）檢測(cè)精子的頂體完整性。500 μL PBS 中加入5 μL 解凍后的精液混勻，而后加入5 μL FITC-PSA 混勻，在室溫下避光孵育30 min 后進(jìn)行流式檢測(cè)。據(jù)熒光強(qiáng)度判斷精子的頂體完整性，熒光強(qiáng)度越高說(shuō)明精子的頂體完整性越好。

1.3.4 質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸分布檢測(cè) 磷脂酰絲氨酸外翻是細(xì)胞早期凋亡的重要標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)解凍后精子細(xì)胞磷脂酰絲氨酸分布進(jìn)行檢測(cè)，Annexin V 可以特異性地標(biāo)記磷脂酰絲氨酸，因此可以反映精子的凋亡狀態(tài)。具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。精子經(jīng)Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）標(biāo)記后分為4 個(gè)細(xì)胞亞群，如圖2 所示，左下角細(xì)胞亞群代表正常精子（Annexin V 和 PI 均陰性）；右下角細(xì)胞亞群代表早期凋亡細(xì)胞群（Annexin V 陽(yáng)性，PI 陰性）；左上角細(xì)胞亞群代表壞死細(xì)胞；右上角細(xì)胞亞群代表晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V 和PI 陽(yáng)性）。

圖2 質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸分布檢測(cè)

1.3.5 ROS 檢測(cè) 將500 μL 精液樣品用TALP 液稀釋至終濃度為1×106精子/mL，與0.5 μL 2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）和50 μL PI（50 μg/mL）混合。H2DCFDA 終濃度為20 μmol/L。然后，將樣品在室溫下避光孵育60 min。采用流式細(xì)胞儀對(duì)精子進(jìn)行分析。正常精子由于無(wú)活性氧產(chǎn)生，為H2DCFDA 和PI 陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 將每次采集的精液混合以消除個(gè)體差異，本實(shí)驗(yàn)精液采自8 只不同種公羊。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（LSD），數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 或P＜0.01 表示處理組間差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)山羊凍精活力的影響 如圖3 所示，解凍后對(duì)照組凍精的精子活力與10 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組差異不顯著，但這2 組高于20 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組（P＜0.05）。10 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組的直線運(yùn)動(dòng)百分率高于其他各冷凍組（P＜0.05），20 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組低于其他各處理組（P＜0.05）。

圖3 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子活力的影響

2.2 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子質(zhì)膜完整性的影響 如圖4 所示，10 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組精子彎尾率為28.53%，高于其他各處理組（P＜0.05），而其他各組間無(wú)顯著差異。

圖4 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子彎尾率的影響

2.3 白藜蘆醇對(duì)山羊凍精頂體完整性的影響 如表1 所示，白藜蘆醇不能改善解凍后山羊凍精的頂體完整性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管10 μmol/L 白藜蘆醇冷凍組精子頂體完整性最高，為49.76%，但各處理組精子頂體完整性之間差異不顯著。

2.4 白藜蘆醇對(duì)山羊凍精磷脂酰絲氨酸分布的影響 本實(shí)驗(yàn)中，Annexin V 陽(yáng)性細(xì)胞群代表磷脂酰絲氨酸外翻的細(xì)胞群。結(jié)果表明，解凍后早期凋亡細(xì)胞群很少，低于5%。大部分磷脂酰絲氨酸外翻的精子細(xì)胞集中于晚期凋亡亞群。然而，各處理組的磷脂酰絲氨酸標(biāo)記率差異不顯著（表2）。此外，添加白藜蘆醇并不能顯著提高精子的活率。

表1 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子頂體完整性的影響

表2 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子活率和磷脂酰絲氨酸分布的影響 %

2.5 白藜蘆醇對(duì)山羊凍精ROS 的影響 圖5 顯示，當(dāng)白藜蘆醇濃度為10 μmol/L 時(shí)，ROS 陰性精子62.85%高于其他各組（P＜0.05），而其他組間沒(méi)有顯著差異。

圖5 白藜蘆醇對(duì)山羊冷凍精子ROS 的影響

3 討 論

由于目前的凍精制作技術(shù)所限，無(wú)法完全隔絕精子與空氣的接觸，這可能導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而對(duì)精子造成氧化損傷。此外，正常情況下，精液中的總抗氧化能力和抗氧化成分可以維持ROS 產(chǎn)生和降解的一種動(dòng)態(tài)平衡。但在凍精制作過(guò)程中，由于需要添加稀釋液而造成精液抗氧化成分濃度降低和總抗氧化能力降低，最終導(dǎo)致精子的氧化損傷。此外，精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)含有豐富的不飽和脂肪酸，這也導(dǎo)致其對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化高度敏感[3]。脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致ROS 的形成，最終破壞精子的結(jié)構(gòu)和功能。而在精液中添加一定的外源性抗氧化成分，如二丁基羥基甲苯（BHT）、維生素E，是降低精子氧化損傷的重要措施[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中，在冷凍稀釋液中添加白藜蘆醇能夠顯著改善山羊冷凍精液的直線運(yùn)動(dòng)百分率和質(zhì)膜完整性。同時(shí)，白藜蘆醇可以抑制精子冷凍解凍過(guò)程中ROS 的生成，進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇是通過(guò)其抗氧化作用改善凍精品質(zhì)。

關(guān)于小鼠[14]、人[15]、牛[4,10]、羊[11]精子的研究表明，白藜蘆醇可以有效保護(hù)精子免受冷凍或補(bǔ)充促氧化劑引起的氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，當(dāng)冷凍稀釋液中白藜蘆醇濃度為10 μmol/L 時(shí)，解凍后精子的直線運(yùn)動(dòng)百分率顯著高于對(duì)照組；但當(dāng)白藜蘆醇濃度提高至20 μmol/L 時(shí)，直線運(yùn)動(dòng)百分率呈下降趨勢(shì)。對(duì)馬精子[5]的研究表明，當(dāng)白藜蘆醇濃度為10 μmol/L 時(shí)，解凍后直線運(yùn)動(dòng)百分率顯著高于對(duì)照組，而較高濃度（20 μmol/L）白藜蘆醇對(duì)直線運(yùn)動(dòng)百分率有負(fù)作用，與本研究結(jié)果一致。本研究中，20 μmol/L 白藜蘆醇組精子活力顯著低于對(duì)照組和10 μmol/L 白藜蘆醇組，20 μmol/L 白藜蘆醇組的直線運(yùn)動(dòng)百分率顯著低于其他各處理組，說(shuō)明高濃度白藜蘆醇（20 μmol/L）對(duì)精子的活力和直線運(yùn)動(dòng)速率有抑制作用。還有研究表明，當(dāng)白藜蘆醇濃度過(guò)高（66 μmol/L 或100 μmol/L）時(shí)，對(duì)豬精子運(yùn)動(dòng)有抑制作用[16]。不同研究結(jié)果的白藜蘆醇高濃度值不同，可能是不同物種精子對(duì)白藜蘆醇的敏感性不同或者稀釋液成分不同造成的。此外，白藜蘆醇對(duì)凍精活力的改善效果可以通過(guò)其降低ROS 生成的作用來(lái)解釋[10]。有研究證實(shí)，通過(guò)添加外源性抗氧化劑可有效抑制ROS 產(chǎn)生，從而保護(hù)精子的結(jié)構(gòu)和功能，提高精子的受精能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白藜蘆醇濃度為10 μmol/L 時(shí)，ROS 陰性的精子百分率顯著高于其他各組。另外，10 μmol/L 白藜蘆醇顯著提高冷凍精子的低滲耐受性，這表明白藜蘆醇可以顯著提高解凍后精子質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性。在馬上的研究也得到證實(shí)[5]。

本研究也表明，過(guò)高濃度的白藜蘆醇可能對(duì)精子產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，最終導(dǎo)致其精子活力和質(zhì)膜完整性下降，但原因尚不清楚。頂體是精子特有的結(jié)構(gòu)之一，富含各種水解酶類，受精過(guò)程中頂體反應(yīng)是精卵結(jié)合的前提條件。在本研究中，白藜蘆醇并不能改善凍精的頂體完整性，這與人[11]的研究結(jié)果不同，原因可能與精液來(lái)源和冷凍解凍流程不同有關(guān)。此外，高濃度的抗氧化劑可能破壞精子頂體和膜的功能完整性[6]。根據(jù)目前的報(bào)道，精子的低滲耐受性可能和其受精能力相關(guān)[18]。在豬上，盡管白藜蘆醇對(duì)精子活率和質(zhì)膜完整性無(wú)影響，但能顯著提高其體外受精率[19]。盡管本研究證實(shí)白藜蘆醇可以顯著提高凍精的低滲耐受性，但由于并未進(jìn)行體外受精或人工授精實(shí)驗(yàn)，關(guān)于白藜蘆醇是否可以改善凍精的受精能力尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

白藜蘆醇可有效提高山羊精子對(duì)冷凍損傷的耐受性，而且其保護(hù)效果呈明顯的劑量依賴性。隨著白藜蘆醇濃度的升高，其直線運(yùn)動(dòng)速率、質(zhì)膜完整性和ROS陰性精子百分率呈先上升而后下降的趨勢(shì)。白藜蘆醇對(duì)精子的冷凍保護(hù)作用可能與其抑制ROS 產(chǎn)生有關(guān)。但過(guò)高濃度的白藜蘆醇不能緩解冷凍解凍過(guò)程對(duì)精子的冷凍損傷，推測(cè)白藜蘆醇濃度過(guò)高可能對(duì)精子產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。另外，白藜蘆醇能否改善山羊凍精人工授精效果仍需要進(jìn)一步研究。