王 亨，王葉帆，祝啟成，陶璐瑤，崔璐瑩，孟 霞，朱國(guó)強(qiáng)，李建基*

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

在奶牛發(fā)情、排卵后，卵巢上排卵卵泡的體細(xì)胞發(fā)育為黃體細(xì)胞，形成黃體。受精卵完成早期發(fā)育并附植后，黃體繼續(xù)發(fā)育為妊娠黃體，妊娠黃體是妊娠期所需孕酮的主要來(lái)源。已有研究表明，孕酮能夠調(diào)控細(xì)胞增殖，維持黏膜上皮的生長(zhǎng)，并刺激子宮腺生長(zhǎng)和分泌[1]，調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞增殖和分化[2]，同時(shí)也參與調(diào)控乳腺腫瘤發(fā)生過(guò)程[3]，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[4]，故孕酮具有促進(jìn)多種細(xì)胞增殖的作用，推測(cè)孕酮可能參與調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜修復(fù)的過(guò)程。Wnt 信號(hào)通路廣泛存在于真核生物，可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞分化、增殖等。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt 通路，一旦被激活，β-catenin 在胞質(zhì)中積聚，至一定程度即發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[5]。有研究表明，孕激素可調(diào)控Wnt/β-catenin 的活性，使子宮內(nèi)膜在增生和分化階段維持相對(duì)穩(wěn)定[6]。當(dāng)奶牛產(chǎn)犢后，發(fā)生子宮內(nèi)膜炎的奶牛孕酮維持在較高水平[7]，故高水平的孕酮可能抑制了奶牛子宮內(nèi)膜復(fù)舊，這種影響可能涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄?；诖?，本研究通過(guò)驗(yàn)證不同濃度的孕酮對(duì)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響，研究孕酮對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin 通路在奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生中的作用及其機(jī)制提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Thermo 公司，美國(guó)）；PVDF 膜（Millipore 公司，德國(guó)）；CCK-8 檢測(cè)試劑盒（DOJINDO 公司，日本）；DMEM/F12 培養(yǎng)基和鏈蛋白酶（Sigma 公司，美國(guó)）；無(wú)內(nèi)毒素胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；胰蛋白酶（Amresco 公司，美國(guó)）等。

1.2 原代奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（BEECs）的培養(yǎng) 無(wú)菌采集奶牛子宮，在超凈臺(tái)內(nèi)取子宮角，用預(yù)冷的、含有雙抗的PBS 反復(fù)沖洗，至液體澄清。將子宮角縱向剖開(kāi)，修剪為約3 cm×3 cm 的組織塊放入50 mL 無(wú)菌離心管中，加入0.1%鏈霉蛋白酶，至完全浸沒(méi)子宮角組織，于4℃冷消化16～20 h。冷消化結(jié)束后，用滅菌手術(shù)刀輕輕刮取組織塊的子宮角內(nèi)膜，放置于PBS 中重懸，1 200 r/min 離心5 min 棄去上清液，再加PBS重懸細(xì)胞，以同樣條件離心，重復(fù)3 次。然后加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d 換1 次細(xì)胞培養(yǎng)液，3～4 d 可獲得原代細(xì)胞。經(jīng)免疫熒光鑒定，培養(yǎng)所得細(xì)胞為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，純度達(dá)90%以上。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)孕酮對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力的影響 將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞按103cells/孔濃度接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)，待細(xì)胞增殖匯合至80%左右，更換含不同濃度孕酮（0、1、3、5 ng/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS 洗滌，每孔3 次。每孔加入10 μL CCK-8 和100 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)混液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。在波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)吸光度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，檢測(cè)孕酮對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力的影響。

1.4 免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)孕酮對(duì)Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞以106cells/孔的比例接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞增殖匯合至80%左右時(shí)，更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)加入孕酮（1、3、5 ng/mL），并設(shè)對(duì)照組，處理15 min，收集細(xì)胞。加入裂解液裂解30 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清；BCA 法測(cè)定蛋白濃度；取10 μL 蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE 電泳；采用半干法轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5% 脫脂乳室溫封閉2 h；加入兔抗β-catenin、cyclin D1、c-Myc 和β-actin（CST 公司，美國(guó)），4℃孵育12～14 h；TBST 洗膜5 次；加入山羊抗兔IgG二抗（CST 公司，美國(guó)）的封閉液中，室溫孵育2 h；TBST 洗膜5 次；ECL 發(fā)光液顯影并拍照、分析和保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件、One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 孕酮對(duì)奶牛內(nèi)膜上皮細(xì)胞活性的影響 圖1 顯示，添加1 ng/mL 和3 ng/mL 孕酮提高了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖率，5 ng/mL 孕酮降低了該細(xì)胞的增殖率，但4 組間差異均不顯著。

圖1 孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活性的影響

2.2 孕酮對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組相比，1 ng/mL 和3 ng/mL孕酮促進(jìn)了β-catenin 蛋 白 的 表 達(dá)（P＜0.01），且1 ng/mL 孕酮能夠更明顯地促進(jìn)β-catenin蛋白的表達(dá)；而5 ng/mL 孕酮?jiǎng)t抑制β-catenin 表達(dá)（P＜0.05）。同時(shí)，1、3 n、5 ng/mL 孕酮均明顯促進(jìn)了cyclin D1 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。此外，與對(duì)照組相比，3 個(gè)劑量孕酮均明顯促進(jìn)了c-Myc 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），且隨著孕酮濃度的增加，5 ng/mL 孕酮組c-Myc 蛋白表達(dá)開(kāi)始下降。

圖2 孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

奶牛子宮內(nèi)膜由單層柱狀上皮層和固有層組成，上皮細(xì)胞受激素影響，發(fā)生周期性的變化。奶牛妊娠期間，孕酮維持在較高水平，分娩后孕酮水平急劇降低，外周血孕酮水平下降至5 ng/mL 以內(nèi)[1]。本研究細(xì)胞試驗(yàn)選用1、3、5 ng/mL 孕酮工作濃度，旨在模擬產(chǎn)后子宮內(nèi)分泌環(huán)境。CCK-8 試驗(yàn)結(jié)果證明，未發(fā)現(xiàn)孕酮濃度對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的促增殖和/或毒性作用，為后期研究工作奠定了基礎(chǔ)。

Wnt 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、抗感染、修復(fù)和分化中起到重要作用[8-10]，分為依賴于β-catenin 的經(jīng)典信號(hào)通路和非依賴β-catenin 的非經(jīng)典信號(hào)通路[11]。在Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號(hào)通路中，Wnt 蛋白與特異性受體卷曲蛋白（Frizzled、FRZ）和/或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5/6）結(jié)合后，激活蓬亂蛋白（Dishevelled、Dvl），抑制降解復(fù)合物糖原合成酶激酶（Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β）、軸素（Axin）、大腸腺瘤樣蛋白（Adenomatouspolyposis Coli，APC）和酪蛋白激酶1α（Casein Kinase 1α，CK1α），穩(wěn)定β-catenin 在胞質(zhì)中的存在并逐漸累積，最后轉(zhuǎn)位入核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合（T-cell Factor/Lymphoid Enhancing Factor，TCF/LEF），調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5]，如增殖相關(guān)基因c-myb、cyclin D1、c-myc等。本研究結(jié)果表明，1 ng/mL 和3 ng/mL 孕酮可以明顯促進(jìn)β-catenin蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)下游蛋白cyclin D1、c-myc 表達(dá)水平升高，說(shuō)明孕酮抑制了降解復(fù)合物的形成，使β-catenin 積聚，并轉(zhuǎn)位入核，激活了下游cyclin D1、c-myc 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，孕酮可以上調(diào)子宮內(nèi)膜癌ECC1 和HEC1A 細(xì)胞Wnt 的表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜息肉組織中Wnt 的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，證實(shí)Wnt 參與了子宮內(nèi)膜的增殖[12]，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。同時(shí)，本研究，隨著孕酮濃度升高，5 ng/mL 孕酮可以明顯抑制β-catenin 的表達(dá)，且下游cyclin D1、c-myc 蛋白表達(dá)相比低劑量孕酮組出現(xiàn)下降，說(shuō)明高濃度孕酮影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖。Wang 等[13]對(duì)月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的變化研究發(fā)現(xiàn)，在增殖期，雌激素水平升高誘導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活，而分泌期時(shí)，黃體分泌的孕激素可以抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，拮抗雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，促進(jìn)分化。故當(dāng)孕酮水平增高至一定程度，會(huì)拮抗或者抑制細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果可以部分解釋奶牛產(chǎn)后發(fā)生子宮內(nèi)膜炎時(shí)，常伴有持久黃體和外周血高水平孕酮，繼而影響子宮復(fù)舊，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎的病程和治療周期延長(zhǎng)。故Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖和產(chǎn)后子宮復(fù)舊過(guò)程，這一作用可能與產(chǎn)后高孕酮水平下發(fā)生的子宮內(nèi)膜炎有關(guān)。

綜上所述，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在低濃度孕酮下可促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖，但高濃度孕酮抑制了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和激活，繼而可能參與了奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生，并導(dǎo)致子宮復(fù)舊延遲，這為奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎等相關(guān)疾病的研究提供新的思路和方法。