肖紅衛(wèi)，華文君，華再東，任紅艷，張立蘋，鄭新民，朱 喆，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北省動(dòng)物胚胎工程與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

隨著動(dòng)物發(fā)育到性成熟，生殖細(xì)胞中的親本基因組需要通過(guò)包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、組蛋白替換等在內(nèi)的一系列表觀遺傳修飾，變成高度特化的精子和卵母細(xì)胞[1]。受精后胚胎在早期發(fā)育階段經(jīng)歷了全基因組重編程，擦除表觀修飾，形成全能性的合子，從而啟動(dòng)胚胎發(fā)育[2-3]。前人通過(guò)一系列的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠受精后胚胎基因組激活發(fā)生在2-細(xì)胞（2-cell）胚胎階段[4-7]，在胚胎基因組激活前，合子發(fā)育由卵子發(fā)生過(guò)程中儲(chǔ)存在成熟卵母細(xì)胞質(zhì)中的母源因子（包括mRNA 和蛋白質(zhì)）所調(diào)控。母體基因表達(dá)是卵母細(xì)胞成熟和早期卵裂的重要生物學(xué)過(guò)程。Cui 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，大量基因在GV 期卵母細(xì)胞中的表達(dá)量與在MII 期卵母細(xì)胞中的表達(dá)量發(fā)生變化。在GV 卵母細(xì)胞中上調(diào)的基因更可能參與蛋白質(zhì)代謝和修飾、有絲分裂細(xì)胞周期、電子傳遞或受精或?qū)儆谖⒐?細(xì)胞骨架蛋白家族。在MII 卵母細(xì)胞中特異性上調(diào)的基因更可能參與DNA復(fù)制、氨基酸代謝或G 蛋白偶聯(lián)受體和信號(hào)分子的表達(dá)。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，這些母源因子啟動(dòng)早期胚胎發(fā)育，隨后基因組開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)新的基因和合成新的因子，并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成更多的細(xì)胞因子，保持早期胚胎繼續(xù)發(fā)育[8]。上述科學(xué)家通過(guò)大量的先進(jìn)研究方法，驗(yàn)證出小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中母源基因向合子基因轉(zhuǎn)換的時(shí)機(jī)在胚胎發(fā)育的2-cell 期，但是這些胚胎活檢方法復(fù)雜，容易受到分子檢測(cè)的假陽(yáng)性的影響，需要能夠可以實(shí)時(shí)、直觀觀察小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中母源基因向合子基因轉(zhuǎn)換的時(shí)機(jī)方法。

EGFP基因來(lái)源于水母（Aequorea victoria）[9-13]，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)EGFP基因的胚胎，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因胚胎有綠光[13]。本研究利用EGFP基因作為報(bào)告基因，通過(guò)轉(zhuǎn)增強(qiáng)型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀/♂）分別與野生型小鼠進(jìn)行交配所得到的胚胎，研究小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中母源基因向合子基因組轉(zhuǎn)換的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及胚胎來(lái)源 選擇6～8 周齡（20 g 左右）EGFP轉(zhuǎn)基因的公、母昆明小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物生物技術(shù)研究室提供[13]。6～8 周齡（20 g 左右）普通昆明小鼠包括5～6 周齡的健康母鼠和7～8 周齡的健康公鼠，由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由采食，自由飲水，每籠飼養(yǎng)小鼠5 只，墊料為鋸木屑。環(huán)境溫度與濕度不限制；照度為每天13 h 光照:11 h 黑暗；噪音無(wú)；環(huán)境清潔度屬SPF動(dòng)物房。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的級(jí)別屬SPF 級(jí)[13]。

1.1.2 主要試劑與儀器 孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）均購(gòu)自寧波三生藥業(yè)有限公司；Olympus IX70 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠與普通昆明小鼠交配EGFP轉(zhuǎn)基因母鼠與普通昆明小鼠交配，以及EGFP轉(zhuǎn)基因公鼠與普通昆明小鼠交配。

1.2.2 胚胎采集 合籠第2 天檢查陰栓，見栓后4 h 內(nèi)以及見栓后4～28 h，頸椎脫臼法處死母鼠，75% 酒精消毒后切開腹腔，剪下輸卵管及連接的一小段子宮，置于有PBS 的平皿中，顯微鏡下用注射器從輸卵管壺腹部、子宮角收集胚胎，并在鏡下清洗后置于有M16 液滴的培養(yǎng)皿中，置37℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察 把沖出的受精胚置于熒光顯微鏡下，用波長(zhǎng)490 nm 的紫外光觀察，濾光片為ND25 和WIB。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究利用小鼠配子發(fā)育中的減數(shù)分裂以及受精的原理，在轉(zhuǎn)增強(qiáng)型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀）與野生型小鼠進(jìn)行交配的實(shí)驗(yàn)中，EGFP基因只能來(lái)自母鼠，所以用EGFP基因模擬母源基因；在轉(zhuǎn)增強(qiáng)型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♂）與野生型小鼠進(jìn)行交配的實(shí)驗(yàn)中，EGFP基因只能來(lái)自公鼠，所以用EGFP基因模擬合子基因/父源基因。熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的時(shí)期就是母源基因向合子基因組轉(zhuǎn)換的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)EGFP基因母鼠與普通昆明小鼠交配 收集轉(zhuǎn)EGFP基因母鼠與普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在熒光顯微鏡下觀察所收集到的胚胎，可以觀察到熒光，熒光主要分布在受精胚以及周圍的顆粒細(xì)胞中（圖1）。說(shuō)明作為轉(zhuǎn)入的外源基因在卵母細(xì)胞發(fā)育以及受精之前就已經(jīng)表達(dá)。

圖1 EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠（母鼠）以及所取的胚胎

2.2 轉(zhuǎn)EGFP基因公鼠與普通昆明小鼠交配 收集轉(zhuǎn)EGFP基因公鼠與普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在熒光顯微鏡下觀察收集所得的胚胎，直到2-cell 期的胚胎時(shí)才可以見到有熒光（圖2），熒光主要分布在受精胚中（圖2 中的綠色熒光部分）。說(shuō)明作為轉(zhuǎn)入的外源基因在卵母細(xì)胞受精之后才開始表達(dá)。

圖2 EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠（公鼠）以及所獲得的胚胎

2.3EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的后代 收集EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的胎兒，在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因后代小鼠胎兒中的熒光分布與胚胎發(fā)育初期中的分布特征并不一致，有全身呈現(xiàn)熒光的，也有在身體末端呈現(xiàn)熒光（圖3-A），或者只有很淺的熒光（圖3-B）。

圖3 EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠的后代

3 討 論

母體-合子轉(zhuǎn)變（Maternal-To-Zygotic Transition，MZT）過(guò)程是一個(gè)保守的過(guò)程，在此過(guò)程中母體環(huán)境通過(guò)顯著的重編程轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ヲ?qū)動(dòng)發(fā)育的環(huán)境，這是繼續(xù)發(fā)育所必需的[1]。在卵子發(fā)生過(guò)程中，哺乳動(dòng)物卵子會(huì)積累早期胚胎發(fā)生所需的蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)表明母源因子在染色質(zhì)重編程和胚胎基因組激活中起著至關(guān)重要的作用。Yang 等[14]通過(guò)斑馬魚早期胚胎中RNA5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾的全基因組分析發(fā)現(xiàn)，m5C mRNA修飾在MZT 期間動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)母源基因轉(zhuǎn)錄物的分子機(jī)理。Zheng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，母源因子在早期切割小鼠胚胎發(fā)生中維持染色體穩(wěn)定性和整倍性的作用。Filia 在生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中表達(dá)，編碼一種與MATER 結(jié)合的蛋白質(zhì)，并參與卵裂期胚胎發(fā)育所必需的皮質(zhì)下母體復(fù)合物。Filia 母體貯存的消耗削弱了胚胎植入前胚胎發(fā)育的非整倍性，這是由于異常的紡錘體組裝，染色體錯(cuò)位和紡錘體組裝檢查點(diǎn)（SAC）失活引起的。為了確保正常的紡錘體形態(tài)發(fā)生，F(xiàn)ilia 通過(guò)RhoA 信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)關(guān)鍵紡錘體組裝調(diào)節(jié)劑（即AURKA，PLK1 和微管蛋白）在微管組織中心的正確分配。同時(shí)，F(xiàn)ilia 蛋白需要將MAD2（SAC 的一個(gè)重要組成部分）放置到動(dòng)粒上，以實(shí)現(xiàn)SAC 功能[15]。Tsunemoto 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞和植入前胚胎中3 種小鼠母體基因（H1oo，Npm2和Zar1）的啟動(dòng)子區(qū)域在卵母細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性，但在受精胚胎中沒(méi)有。Cui 等[8]、Sekita 等[17]證明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的Rtl1（反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣1），也稱為Peg11（父本表達(dá)11），對(duì)于維持胎兒毛細(xì)血管必不可少，并且其損失和其過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致晚胎和/或新生兒老鼠的致死率。然而，卵受精后到胚胎基因組轉(zhuǎn)錄激活存在著一定的過(guò)渡期，小鼠胚胎發(fā)育時(shí)基因組的激活時(shí)間確定是研究的難點(diǎn)。本研究以EGFP轉(zhuǎn)基因鼠為研究對(duì)象，以EGFP蛋白為基因組激活的標(biāo)志物，在熒光顯微鏡下觀察，小鼠胚胎在2-cell 期出現(xiàn)熒光，因此判斷2-細(xì)胞胚胎期為基因組激活的時(shí)間點(diǎn)，這一結(jié)果與前人[6-7]的結(jié)果一致。

Zhou 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在著床后早期的時(shí)間窗口內(nèi)可能參與特異性調(diào)控關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，與基因轉(zhuǎn)錄共同協(xié)調(diào)決定了不同細(xì)胞譜系的發(fā)育潛能特化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中收集到EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠胎兒體內(nèi)的熒光分布與胚胎發(fā)育初期中的分布特征并不一致，可能是因?yàn)槎嗉?xì)胞生物體由具有相同基因組的不同細(xì)胞類型組成，在器官組織發(fā)育過(guò)程中，無(wú)論在發(fā)育過(guò)程還是疾病狀態(tài)下，表觀遺傳因素（不改變DNA 序列的情況下）在細(xì)胞命運(yùn)決定中起著指導(dǎo)性作用，細(xì)胞類型和功能異質(zhì)性往往通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[19]。