狄 冉，劉秋月，王翔宇，胡文萍，夏 青，馬 琳，張效生，張金龍，張仁森，潘章源，儲明星

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193）

綿羊（Ovis Aries）是最早被人類馴化的家畜物種之一。綿羊為人類提供了優(yōu)質(zhì)肉、奶、毛和皮，因此是一個重要的家畜物種。對于綿羊而言，產(chǎn)羔數(shù)性狀是其重要經(jīng)濟性狀中所占權重最大的生產(chǎn)性狀，對養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟效益的貢獻可以達到74%～96%。據(jù)不完全統(tǒng)計，產(chǎn)雙羔所獲的經(jīng)濟效益是產(chǎn)單羔的1.6 倍以上[1]。然而，大多數(shù)綿羊?qū)僖惶胃崞贩N，為了提高經(jīng)濟效益，多羔一直是人們追求的育種目標。由于羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳力僅為0.1左右，對其選擇還受到性別（限性性狀）等因素的制約，故用常規(guī)育種技術改良該性狀很難在短期內(nèi)獲得較大的遺傳進展。因此，挖掘多羔關鍵基因、開發(fā)分子標記并用于標記輔助育種是加快遺傳進展的重要舉措。

產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復雜的性狀，受到遺傳背景、營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響，其中遺傳因素最為重要。目前在中國綿羊品種中鑒定到的多羔基因主要是FecB[2-7]。雖然FecB基因型在一些品種例如小尾寒羊中是分離的，但在不攜帶FecB突變的小尾寒羊中仍然能夠觀測到連續(xù)的高產(chǎn)羔數(shù)現(xiàn)象，這表明我國綿羊中很可能還存在其他多羔主效基因。

全基因組選擇信號分析是目前挖掘功能基因的一種重要的方法[8-14]。本團隊前期通過對10 個綿羊品種（按照單、多羔進行分組）的全基因組重測序，定義Z（Fst）>5 為顯著位點，篩選獲得了可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關的候選基因——通用轉錄因子2A1（GTF2A1，General transcription factor 2A1）及其突變位點（7 號染色體基因組序列第89505005bp 位點，位于內(nèi)含子區(qū)域），其Z（Fst）值為6.37，提示該基因可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關。該基因是與RNA 聚合酶Ⅱ轉錄引發(fā)所需的TFIID-啟動子復合物相互作用的一種轉錄因子[15]。Lawal 等[16]利用紅色原雞作對照，分析了非洲地方雞品種可能受選擇的基因組區(qū)域，其中只有1 個區(qū)域存在注釋基因（TSHR和GTF2A1），作者認為這些受選擇的基因可能與雞種適應當?shù)氐臍夂驐l件、繁殖等性狀相關。Yuan 等[17]利用白來航和東鄉(xiāng)綠殼雞雜交產(chǎn)生的1 534 只F2代母雞進行產(chǎn)蛋性狀的GWAS 分析，發(fā)現(xiàn)GTF2A1和CLSPN基因影響了母雞卵巢和子宮的功能，二者可能是產(chǎn)蛋的候選基因。Huang 等[18]報道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，該基因可作為卵巢癌檢測的一個分子標記。Lee 等[19]的研究結果認為GTF2A1與白血病相關的IL1B-31C 基因互作從而引發(fā)胃癌風險。然而目前未見GTF2A1與羊多羔性狀有關的報道。因此，本研究以多羔和單羔的綿羊群體及產(chǎn)羔數(shù)存在差異的小尾寒羊大群為研究對象，利用Sequenom MassARRAY?SNP技術進行SNP 分型檢測，分析GTF2A1基因上述突變位點與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關系，以期為綿羊高繁殖力性狀的標記輔助選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 具有產(chǎn)羔數(shù)記錄的多羔綿羊品種小尾寒羊380 只（來自同一個保種場同一個群體，飼養(yǎng)管理條件一致，年齡均為2～3 歲），記錄產(chǎn)羔數(shù)均為1 的綿羊群體（灘羊、蘇尼特羊、薩福克羊、杜泊羊和草原型藏羊）共380 只（具體數(shù)量見表1）。飼養(yǎng)管理條件基本一致。

1.2 試劑及儀器 試劑：血液基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；Complete Genotyping Reagent Kit（for MassARRAY?Compact 384），購自北京君諾德生物技術有限公司（Beijing Genenode Biotech Co,Ltd）。儀器包括基因擴增：ABI GeneAmp?9700 384 Dual；質(zhì)譜點樣：MassARRAY NanodispenserRS1000；質(zhì)譜分析：MassARRAY Compact System。

1.3 基因組DNA 的提取 綿羊頸靜脈采血1 mL，用EDTA 抗凝處理。使用天根血液DNA 試劑盒提取DNA，并進行DNA 濃度和質(zhì)量檢測。

1.4 采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術進行基因分型 針對綿羊第7 號染色體基因組序列第89505005 bp位點（基于綿羊基因組版本號Oar_v3.1）設計引物組。PCR 擴增使用的上游引物序列為：ACGTTGGATGATG AAATCCATCTACCGCCC；下游引物序列為：ACGTT GGATGATCCCCATGTCCAGATCTTC。延伸引物序列為：GCATTAGTTTATTCTCCCATAACT，延伸方向是正向。上述引物由君諾德公司合成。將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384 孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上，進行MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜）反應，利用Typer 4.0 軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標位點基因型。

1.5 統(tǒng)計分析 應用Microsoft Excel 2016 軟件統(tǒng)計綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點的等位基因頻率、基因型頻率、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）等指標，隨后進行Hardy-Weinberg 檢測。使用yijkl=μ+Pj+Gk+eijkl 模型進行最小二乘方差分析，其中，yijkl 為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ 為群體平均值；Pj 為第j 個胎次的固定效應，j=1,2,3；Gk 為該基因第k 種基因型的固定效應，k=1,2,3；eijkl為隨機殘差效應；誤差項e 服從正態(tài)分布N（0,σ2）。用SPSS19.0 軟件程序中一般線性模型進行小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

表1 被測綿羊品種及個體數(shù)量信息

2 結果與分析

2.1GTF2A1基因多態(tài)性分析 通過基因分型發(fā)現(xiàn)，GTF2A1基因g.89505005G>A 位點在單、多羔綿羊品種中均存在3 種基因型：AA、AG 和GG（圖1）。

圖1 綿羊GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點分型結果圖

根據(jù)g.89505005G>A 位點分型結果，統(tǒng)計單、多羔綿羊品種中該位點的基因型頻率和等位基因頻率，由表1 可知，綿羊g.89505005G>A 位點的基因型頻率和等位基因頻率在單、多羔綿羊群體間差異均達到極顯著水平，且多羔群體的優(yōu)勢基因型為AA，優(yōu)勢等位基因為A；單羔群體的優(yōu)勢基因型為GG，優(yōu)勢等位基因為G。

對GTF2A1基因g.89505005G>A 位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學指標進行統(tǒng)計。由表2 和表3 可知，綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25≤PIC＜0.5），在杜泊羊和薩?？搜蛑斜憩F(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m合性檢驗結果表明，該位點在所有6 個被測品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05）。針對該位點，灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊的遺傳多樣性較高，其雜合度和有效等位基因數(shù)數(shù)值高于其他3 個品種數(shù)值。

2.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關聯(lián)分析 將GTF2A1基因g.89505005G>A 位點基因型與小尾寒羊第1 胎、第2 胎和第3 胎產(chǎn)羔數(shù)進行關聯(lián)分析，表4 的統(tǒng)計結果表明，針對所有3 胎數(shù)據(jù)，AA 型的母羊產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于GG 型母羊。

3 討 論

3.1GTF2A1基因與動物繁殖性能的關系 Lawal 等[16]利用紅色原雞為對照，分析了非洲埃塞俄比亞地區(qū)地方雞品種可能受選擇的基因組區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Z（Hp）最低值（-5.8 ± 0.289）位于5 號染色體上涵蓋注釋基因（TSHR和GTF2A1）的區(qū)域，而且這個區(qū)域在多個地方雞種中均存在選擇信號，作者認為這些受選擇的基因可能與雞種適應當?shù)氐臍夂驐l件、繁殖等性狀相關。Yuan 等[17]利用白來航和東鄉(xiāng)綠殼雞雜交產(chǎn)生的1 534 只F2代母雞進行產(chǎn)蛋性狀的GWAS 分析，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)蛋數(shù)最顯著關聯(lián)的區(qū)域包含了GTF2A1和STON2基因，值得注意的是兩者是旁系同源基因；另外，作者推測GTF2A1和CLSPN基因通過影響母雞卵巢和子宮的功能進一步調(diào)控產(chǎn)蛋性能。Huang 等[18]報道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，該基因可作為卵巢癌檢測的一個分子標記。在綿羊中，GTF2A1基因位于7號染色體上，與TSHR和STON2基因相鄰，已有很多文獻表明TSHR與動物繁殖性能相關[20-22]，因此這個區(qū)域值得關注。本課題前期的重測序分析結果也發(fā)現(xiàn)GTF2A1基因在多羔品種中受到了強烈選擇，暗示這個基因可能與綿羊繁殖性能有關聯(lián)。

3.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位點多態(tài)性及其與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關系 群體遺傳學分析發(fā)現(xiàn)，GTF2A1基因g.89505005G>A 位點在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)，在杜泊羊和薩?？搜蛑斜憩F(xiàn)為低度多態(tài)，表明該位點在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中存在較強的選擇潛力。另外，本課題對GTF2A1基因g.89505005G>A 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關聯(lián)分析表明兩者存在一定關聯(lián)，A 等位基因可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的一個潛在有效的DNA 標記。

表2 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點在單、多羔綿羊群體中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學分析

表4 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標準誤

4 結 論

綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點多態(tài)性與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定關聯(lián)，A 等位基因可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的一個潛在有效的DNA 標記。