王珍珍，黃玲玲，趙婉秋，李志梁，劉銀蘭，詹海琴，石孟達(dá)，田 勇，曾 濤，盧立志*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321001；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310023；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；4.新昌縣宮廷黃雞繁育有限公司，浙江紹興 312530）

微衛(wèi)星是一種簡單重復(fù)的2～4 個(gè)核苷酸序列基序，兩側(cè)有獨(dú)特的序列，由于它們是共顯性的，可以檢測到高水平的等位基因多樣性，并且易于用PCR 進(jìn)行分析，因此作為遺傳標(biāo)記是有價(jià)值的[1]。微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱STR（Short Tandem Repeat）或SSR（Simple Sequence Repeats），通常用于研究自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)，關(guān)于遺傳變異在種群間的分配不僅在進(jìn)化生物學(xué)和生態(tài)學(xué)中具有重要意義，而且在保護(hù)生物學(xué)中也具有重要意義[2]。由于其重復(fù)的特征，在DNA 復(fù)制過程中易發(fā)生DNA聚合酶“打滑”現(xiàn)象，導(dǎo)致重復(fù)序列中核心序列重復(fù)次數(shù)的改變而出現(xiàn)突變，因此STRs 也是基因組中變異最快的位點(diǎn)之一[3]，所以STRs 通常與遺傳疾病和基因調(diào)控功能有關(guān)，也是分析進(jìn)化、遺傳多樣性和法醫(yī)鑒定的遺傳標(biāo)記[4]。

我國是家禽飼養(yǎng)及消費(fèi)大國，雞更是生活中最常見的家禽之一，研究雞的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)有助于對(duì)其進(jìn)行合理的開發(fā)與利用。宮廷黃雞是我國頗具特色的地方品種，具有獨(dú)特的外貌特征和很高的觀賞價(jià)值，蛋品質(zhì)優(yōu)良，肉質(zhì)濃郁[5]。本研究利用微衛(wèi)星對(duì)宮廷黃雞遺傳多樣性進(jìn)行檢測，并分析其與浙江省不同地方雞品種間的遺傳結(jié)構(gòu)，為今后新昌宮廷黃雞種質(zhì)資源的保護(hù)和合理的開發(fā)利用提供科學(xué)的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA 提取 60 只宮廷黃雞來自新昌縣宮廷黃雞繁育有限公司，其他5 個(gè)雞品種為絲羽烏骨雞（浙江合興禽業(yè)發(fā)展有限公司）、龍游麻雞（龍游縣田野山莊）、蕭山雞（杭州蕭山東海養(yǎng)殖有限公司）、仙居雞（仙居雞開發(fā)總公司）、白耳黃雞（江山藍(lán)豐種禽有限公司），各60 只。所有個(gè)體用含有抗凝劑Na2EDTA 或K2EDTA 的抗凝管進(jìn)行翅下靜脈釆血，低溫保存，使用TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit 提取基因組DNA。

1.2 引物信息及PCR 擴(kuò)增 首先，根據(jù)GenBank 中所提供的雞的SSR 序列利用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)或者對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)中引物進(jìn)行篩選，最終篩選出核心重復(fù)序列較多，且多態(tài)性豐富的位點(diǎn)。共有26 對(duì)引物擴(kuò)增成功：ADL136，DL166，ADL185，ADL195，ADL210，ADL212，ADL225，ADL123，ADL176，LEI 0166，LEI 0066，MCW 0295，MCW 0014，MCW 67，MCW 0081，MCW 183，MCW 330，MCW 0085，MCW 264，MCW 134，MCW 104，MCW150，MCW32，MCW4，MCW120，MCW174，其 中ADL166、ADL185、MCW0014 和MCW0085 引物序列參考沈立權(quán)[6]，MCW264 和MCW4 引物序列參考李紅霞[7]，ADL176 引物序列參考陳紅菊等[8]，引物由上海英捷生物有限公司合成。

將提取到的基因組DNA 以及合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的PCR 產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆?，含熒光?biāo)記的PCR 產(chǎn)物用 ABI-3730XL DNA Analyzer 全自動(dòng)測序儀檢測DNA。PCR 反應(yīng)體系、擴(kuò)增反應(yīng)程序以及檢測程序參照陶爭榮等[9]和劉雅麗等[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用POPGENE 1.31 軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)，利用GENEPOP 4.2[11]軟件卡方檢驗(yàn)HWE無偏估計(jì)概率值（P）；利用Dispan 軟件統(tǒng)計(jì)各群體間Nei 遺傳距離DA[12]，并進(jìn)行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）聚類分析，基于群體間遺傳距離參數(shù)用MEGA 4.0[13]軟件，構(gòu)建品種間的系統(tǒng)發(fā)生樹；運(yùn)用Gentix4.02[14]軟件中相關(guān)因子分析基于雞群個(gè)體遺傳差異進(jìn)行成分因子分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析 經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表1），去除ADL136、ADL195、ADL210 這3 個(gè)無效等位基因座（文中未呈現(xiàn)具體檢驗(yàn)過程）。宮廷黃雞26 個(gè)微衛(wèi)星座平均等位基因數(shù)（Ne）為4.03 個(gè)，在座位MCW32 上檢測到的基因數(shù)最多，在座位LEI0166 上檢測到的基因數(shù)最少。宮廷黃雞26 個(gè)微衛(wèi)星座多態(tài)信息含量（PIC）均值為0.67，大部分位點(diǎn)PIC 大于0.5，部分位點(diǎn)（ADL123、LEI0166、MCW0085）介于0.25～0.5，為中等多態(tài)性微衛(wèi)星座。觀察雜合度（Ho）與期望雜合度（He）均值分別為0.60、0.72，平均Shannon 信息指數(shù)（I）為1.50。利用GENEPOP 進(jìn)行 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過邦佛倫尼[15]校正（Bonferroni correction）（P＜0.002），26 個(gè)位點(diǎn)中有11 個(gè)位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)。

表1 26 對(duì)STR 引物信息以及遺傳多樣性參數(shù)

2.2 遺傳距離估計(jì) 宮廷黃雞與其他雞品種間的遺傳距離DA見表2，6 個(gè)雞群體中仙居雞和龍游麻雞的DA遺傳距離最小，僅為0.103 5，絲羽烏骨雞和龍游麻雞的DA遺傳距離也比較小，為0.134 5，而宮廷黃雞與其他群體之間的DA遺傳距離均在0.190 0 以上，其中與絲羽烏骨雞DA遺傳距離最小，為0.190 9，與白耳黃雞的DA遺傳距離最大，為0.342 7，事實(shí)上，白耳黃雞與其他群體之間的遺傳距離均在0.300 以上，比其他群體間任意2 個(gè)群體間的DA遺傳距離都高。

表2 宮廷黃雞與其他品種雞群DA 遺傳距離

2.3 聚類分析 基于遺傳距離DA采用NJ 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果見圖1。宮廷黃雞與其他4 個(gè)品種雞群分為一簇，仙居雞先與龍游麻雞聚合再與蕭山雞、絲羽烏骨雞聚合，最終與宮廷黃雞聚合，而白耳黃雞則單獨(dú)作為一簇。

2.4 因子相關(guān)分析（FCA） 基于個(gè)體遺傳差異的FCA 結(jié)果顯示，反映個(gè)體間遺傳差異最主要的3 個(gè)因子（Factor I=37.43%，F(xiàn)actor II=22.37%，F(xiàn)actor III=18.27%）呈現(xiàn)了總變異的78.08%，因而能較好反映群體簇聚情況。從FCA 結(jié)果可知，宮廷黃雞依次與絲羽烏骨雞、龍游麻雞、蕭山雞、仙居雞簇在一起，白耳黃雞單獨(dú)為一簇。

3 討 論

圖1 基于DA 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹（NJ）

3.1 遺傳多樣性 遺傳多樣性是世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）公認(rèn)的值得保護(hù)的3 種生物多樣性形式之一。保護(hù)種群內(nèi)遺傳多樣性需要基于2 個(gè)論點(diǎn)：進(jìn)化發(fā)生的遺傳多樣性的必要性，以及雜合度與種群適應(yīng)性之間的預(yù)期關(guān)系[16]。本研究采用26 個(gè)微衛(wèi)星基因座，對(duì)宮廷黃雞60 個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)宮廷黃雞的26 個(gè)位點(diǎn)的平均PIC 為0.67，其中只有ADL123、LEI0166、MCW0085 3 個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性；本研究所選用的26 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均雜合度高于0.60，為高度多態(tài)位點(diǎn)，表明宮廷黃雞具有豐富的遺傳多樣性，而其Ho（0.60）低于He（0.72），說明其純合子比較多，外界的變化對(duì)于其影響較??；Shannon 信息指數(shù)越大，群體遺傳結(jié)構(gòu)變異性越高，宮廷黃雞26 個(gè)微衛(wèi)星座的平均Shannon 信息指數(shù)I 為1.50，說明該群體遺傳結(jié)構(gòu)變異性比較高。哈代-溫伯格平衡結(jié)果顯示，在26 個(gè)位點(diǎn)中有11 個(gè)位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)，說明這11 個(gè)位點(diǎn)的基因頻率在后代中會(huì)發(fā)生改變。

3.2 遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)生樹 遺傳距離是衡量2 個(gè)不同種群或親緣關(guān)系較近的物種之間遺傳差異的一種方法，通常是利用2 個(gè)種群不同位點(diǎn)的等位基因頻率數(shù)據(jù)來計(jì)算[17]。遺傳距離測量是種群或物種間親緣關(guān)系的指標(biāo)，對(duì)重建種群間的歷史和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有重要意義[18]。遺傳距離的大小可以反映出群體間的親緣關(guān)系[19-21]。本研究結(jié)果表明，與另外5 個(gè)品種相比較，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞遺傳距離最小，即親緣關(guān)系最近，與白耳黃雞親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；仙居雞與蕭山雞的遺傳距離大于仙居雞與龍游麻雞的遺傳距離，這一結(jié)果與曾濤等[22]研究結(jié)果一致?？傮w來看，仙居雞與龍游麻雞的遺傳距離最小，其次是仙居雞與絲羽烏骨雞，白耳黃雞與其他群體之間的距離均在0.33 以上，屬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。以DA遺傳距離為基礎(chǔ)繪制了NJ 遺傳進(jìn)化樹，宮廷黃雞與其他4 品種雞群分為一簇，仙居雞先與龍游麻雞聚合再與蕭山雞、絲羽烏骨雞聚合，最終與宮廷黃雞聚合，而白耳黃雞則單獨(dú)作為一簇，聚類結(jié)果與DA遺傳距離反映結(jié)果一致。

3.3 FCA FCA 是對(duì)數(shù)據(jù)集的歸納探索，通過將主要性狀的數(shù)量減少到更少的因子中，這些因子是原始變量的組合，是方差最大的因子，消除了原始數(shù)據(jù)集中的冗余，可以發(fā)現(xiàn)性狀之間的真實(shí)關(guān)聯(lián)[23]。本研究結(jié)果顯示，6個(gè)不同雞群間的遺傳結(jié)構(gòu)，與基于遺傳距離NJ 系統(tǒng)樹分析結(jié)果一致，白耳黃雞單獨(dú)為一簇，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞最近，而龍游麻雞與仙居雞及蕭山雞遺傳距離較近。

4 結(jié) 論

本研究利用 26 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析宮廷黃雞群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，新昌宮廷黃雞具有豐富的遺傳多樣性，具有較高的保種價(jià)值；遺傳距離分析和聚類分析顯示，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞遺傳距離最近，與白耳黃雞遺傳距離最遠(yuǎn)。