王延國 宮慶娜 楊延霞 王 軍 周忠水

山東省濱州市中心醫(yī)院 1 骨外科 2 麻醉科，山東省惠民縣 251700

骨肉瘤(Osteosarcoma),又稱成骨肉瘤,是臨床常見原發(fā)惡性骨腫瘤，占原發(fā)性惡性骨腫瘤首位(40.51%)，18歲以下的青少年為好發(fā)人群,嚴重影響青少年的身體健康[1-2]。二甲雙胍作為一種經(jīng)典的降糖藥物，其抗腫瘤作用近年來受到廣泛重視[3-4]。本研究項目以人骨肉瘤裸鼠模型及細胞株U2OS、143B細胞為研究對象，分析二甲雙胍在體內(nèi)和體外對人骨肉瘤細胞生長增殖的影響并初步探討其分子機制，為其作為抗骨肉瘤藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS、143B細胞株購自中國科學院北京生命科學院細胞所。細胞培養(yǎng)用胎牛血清、雙抗及DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。二甲雙胍、MTT、Hoechst33342購自上海碧云天生物公司。PI單染試劑盒購自南京凱基生物。細胞培養(yǎng)CO2孵箱為賽默飛世爾(Thermo Fisher公司)儀器。流式細胞計數(shù)儀為Moflo XDP貝克曼庫爾特(Beckman Coulter公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于含雙抗及10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，細胞孵育條件為37℃，5%CO2的濕潤無菌環(huán)境，每2d更換新的培養(yǎng)基。

1.3 二甲雙胍對骨肉瘤細胞生長增殖的影響(MTT法) 骨肉瘤細胞株細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個復孔。二甲雙胍分別作用24、48、72h后，每孔加入濃度為5g/L的MTT溶液10μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，避光輕微震蕩5min使結(jié)晶充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度(A)值，檢測波長580nm，以630nm波長來校正數(shù)值。細胞存活抑制率=(對照組吸光度數(shù)值-二甲雙胍組吸光度數(shù)值)/對照組吸光度×100%。

1.4 細胞凋亡的形態(tài)學觀察(Hoechst33342染色) 把對數(shù)生長繁殖期骨肉瘤細胞接種于蓋玻片，細胞貼壁后，每孔放入二甲雙胍；對照組放入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。作用48h后，棄去藥物，PBS液漂洗2次，細胞固定液固定約30min；吸掉固定液，PBS漂洗2次，加入推薦濃度的Hoechst33342暗室避光反應(yīng)25min；顯微鏡下觀察兩組細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.5 流式細胞術(shù)測定細胞周期時相 將骨肉瘤細胞均勻種植于六孔板上，細胞貼壁后，加入二甲雙胍干預48h，以無EDTA的胰酶消化骨肉瘤細胞并分別收集；PBS漂洗2次，離心棄掉上清液；收集大約105/組細胞加入緩沖液1ml并重懸細胞；繼而加入5μl Annexin V-FITC凋亡檢測試劑及5μl PI試劑，避光反應(yīng)15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 Western Blot法檢測對細胞周期凋亡蛋白的影響 收集不同濃度組處理48h后的骨肉瘤細胞，使用細胞裂解液制備細胞總蛋白，嚴格按Bradford蛋白分析系統(tǒng)按規(guī)定的操作順序檢測細胞蛋白濃度，取等量總蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜24h，5%脫脂牛奶室溫下封閉60min，然后加入各種一抗4℃過夜，之后再加入相應(yīng)二抗室溫下作用60min，TBST洗滌加入ECL顯影劑，上掃描機掃描。

1.7 裸鼠皮下成瘤實驗 40只裸鼠均為雄性，4～6周齡，體重18～20g；右后肢皮下接種腫瘤細胞，6d以后，挑選腫瘤體積100mm3的小鼠24只，并隨機分為4組，每組6只，并稱量體重；分組后第1天即開始給予小鼠藥物注射，4組裸鼠分別給予生理鹽水、二甲雙胍200mg/(kg·d)、順鉑10.0mg/(kg·d)及二甲雙胍聯(lián)合順鉑進行處理，給藥方式為腹腔注射，每72h給藥1次。

1.8 裸鼠的體質(zhì)量及皮下瘤體積的記錄 小鼠每次給藥時，觀察有無死亡小鼠及飲食、毛發(fā)、活動等一般狀態(tài)，定期測量并記錄腫瘤的長徑、短徑并計算體積，腫瘤體積計算方法為：V=1/2L×R2(L為長徑，R為短徑)直至周期結(jié)束。處死小鼠，取出腫瘤稱重記錄，解剖裸鼠，觀察有無腸、肺、肝臟、腦等遠隔臟器侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生；瘤體部分組織制作石蠟切片，以備免疫組化。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用Origin7.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)以means±SD表示，進行t檢驗及其他相關(guān)統(tǒng)計學分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞生長增殖活性 MTT法分別測定人骨肉瘤細胞系U2OS和143B經(jīng)不同濃度二甲雙胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)分別處理24h、48h、72h，觀察以上濃度的二甲雙胍分別聯(lián)合應(yīng)用5μg/ml、10μg/ml順鉑作用于兩種骨肉瘤細胞48h后細胞增殖存活率。兩種細胞系的增殖存活率均隨著二甲雙胍濃度的增加或者處理時間的延長呈下降趨勢(見圖1)，說明二甲雙胍對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞具有明顯的存活抑制作用，且這種作用呈現(xiàn)一定的劑量—時間依賴效應(yīng)。

2.2 二甲雙胍誘導骨肉瘤細胞凋亡的形態(tài)學觀察 本研究采用Hoechst33342對經(jīng)10.0mM 二甲雙胍處理48h的U2OS和143B細胞染色，熒光顯微鏡觀察分析。兩種細胞的空白對照組在熒光顯微鏡下呈均勻微弱藍色熒光，經(jīng)10.0mM二甲雙胍處理48h后的兩種細胞系均不同程度呈現(xiàn)顯著強于對照組的藍色顆粒狀熒光，部分區(qū)域可見代表細胞凋亡的凋亡小體出現(xiàn)(見圖2)。

2.3 流式細胞術(shù)檢測骨肉瘤細胞周期和細胞凋亡 流式細胞術(shù)檢測二甲雙胍作用48h后的細胞周期三個階段中腫瘤細胞的分布情況，顯示二甲雙胍引起U2OS細胞阻滯于S期，143B細胞阻滯于細胞周期G0/G1期。提示二甲雙胍誘導骨肉瘤細胞周期阻滯具有細胞特異性。Annexin V/PI雙染法，經(jīng)流式細胞儀檢測兩種U2OS和143B細胞經(jīng)不同濃度二甲雙胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)處理48h后的凋亡率。結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍處理U2OS和143B細胞48h，可以引起細胞凋亡，且凋亡細胞數(shù)量隨二甲雙胍濃度增加而增加，具有明顯的劑量依賴關(guān)系(見表1)。

2.4 二甲雙胍對骨肉瘤細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響 二甲雙胍處理48h后，內(nèi)部通路(即線粒體介導的凋亡通路)系列信號分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表達量隨二甲雙胍濃度的增加而減少，促凋亡蛋白Bax的表達量隨二甲雙胍處理濃度的增加而明顯增加，處于凋亡信號通路下游的PARP則表現(xiàn)出明顯的剪切化激活。還發(fā)現(xiàn)了細胞色素C釋放到細胞質(zhì)這一凋亡發(fā)生的關(guān)鍵事件。

圖1 二甲雙胍對人骨肉瘤細胞增殖的抑制作用

圖2 二甲雙胍誘導人骨肉瘤細胞凋亡的形態(tài)學觀察

組別nG0/G1(%)S(%)G2/M(%) 凋亡率(%)對照組638.6±2.637.7±5.023.7±8.61.10±0.61二甲雙胍組10mmol/L652.4±1.926.6±2.721.0±2.1 17.50±0.8220mmol/L669.7±6.111.8±4.6 18.5±3.3 26.18±4.41

2.5 裸鼠皮下成瘤實驗 各組小鼠精神狀態(tài)尚可，攝食尚可，反應(yīng)較靈敏，食水量基本正常，順鉑治療組的裸鼠精神稍差，攝食尚可，反應(yīng)不夠靈敏，順鉑聯(lián)合二甲雙胍治療組的小鼠精神狀態(tài)比較差，攝食明顯少于其他治療組，各實驗組間BALB/C小鼠的生長狀態(tài)及生活表現(xiàn)總體良好，各組沒有出現(xiàn)小鼠死亡(見圖3)。

實驗過程結(jié)束后將所有裸鼠脫臼致死，取出瘤體稱重。研究證實單用二甲雙胍可以抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的增殖，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.08)；有效劑量的二甲雙胍聯(lián)合順鉑可以在裸鼠體內(nèi)抑制人骨肉瘤細胞的生長增殖，與對照組或單用順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、3)。二甲雙胍單用組腫瘤轉(zhuǎn)移灶的大小及數(shù)目無顯著差異。

表2 二甲雙胍治療前、后各組裸鼠的體重

表3 二甲雙胍對裸鼠皮下瘤的影響

3 討論

骨肉瘤的治療是當今醫(yī)學界所面臨的重要挑戰(zhàn)之一。由于骨肉瘤本身所具有的生物學特性，使其成為目前尚缺乏有效治愈手段的疾病之一。作為最經(jīng)典的抗糖尿病藥物之一，二甲雙胍具有多重降糖機制。近年來，二甲雙胍因其在抗腫瘤研究中巨大潛力而備受關(guān)注[5]。國內(nèi)外陸續(xù)有文獻報道二甲雙胍對多種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞具有抑制作用，如肺癌[6-7]、大腸癌[8]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9-10]等。本實驗運用免疫熒光實驗、流式細胞術(shù)、免疫印跡實驗等探討二甲雙胍對骨肉瘤細胞系U2OS、143B細胞增殖活性及對細胞周期及細胞凋亡的作用及機制。建立裸鼠荷腫瘤模型，觀察二甲雙胍對腫瘤在裸鼠體內(nèi)的抑制作用。研究結(jié)果顯示二甲雙胍可抑制人骨肉瘤U2OS和143B細胞的增殖活性，且抑制作用具有一定的濃度依賴性和時間依賴性。通過熒光顯微鏡觀察二甲雙胍(10mM,48h)處理組的兩種骨肉瘤細胞系呈現(xiàn)出明顯強于對照組的顆粒狀藍色熒光，且能夠找到凋亡小體的影像。Annexin V/PI雙染法顯示不同濃度二甲雙胍處理U2OS和143B細胞48h能顯著誘導細胞骨肉瘤細胞凋亡。Western Blot方法進行檢測發(fā)現(xiàn)，外部通路(即死亡受體介導的凋亡通路)[11-12]的主要信號分子Fas和Fas-L的表達量在二甲雙胍誘導人骨肉瘤細胞系U2OS和143B的凋亡中并沒有發(fā)生明顯變化；內(nèi)部通路(即線粒體介導的凋亡通路)所涉及的信號分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表達量均隨二甲雙胍處理濃度增加而明顯減少，促凋亡蛋白Bax的表達量隨二甲雙胍處理濃度增加而明顯增加，處于凋亡信號通路下游的PARP則表現(xiàn)出明顯的剪切化激活。還發(fā)現(xiàn)了細胞色素C釋放到細胞質(zhì)這一凋亡發(fā)生的關(guān)鍵事件。這些結(jié)果較為詳細地揭示了二甲雙胍在體外主要是通過內(nèi)部通路(即線粒體介導的凋亡通路)[13-14]途徑來誘導人骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡的機制。

圖3二甲雙胍對人骨肉瘤細胞增殖生長影響的體內(nèi)研究

二甲雙胍體內(nèi)的抗腫瘤實驗報道較少，如Xiong等[15]報道較低劑量的二甲雙胍單用或聯(lián)合應(yīng)用順鉑均能抑制荷肝癌裸鼠腫瘤的體內(nèi)生長。李學玲等[16]報道二甲雙胍能夠抑制裸鼠肺腺癌抑制瘤的增殖活性，單用二甲雙胍抑瘤率為5.12%，順鉑組抑瘤率為22.8%，順鉑聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍組抑瘤率為31.0%。目前國內(nèi)尚未見有關(guān)于二甲雙胍抑制裸鼠荷骨肉瘤抑制瘤生長增殖的報道。本組體內(nèi)試驗部分發(fā)現(xiàn)有效劑量的二甲雙胍聯(lián)合順鉑可在裸鼠體內(nèi)抑制人骨肉瘤細胞系143B細胞生長增殖，與對照組或單用順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

目前二甲雙胍抗腫瘤作用研究主要集中于實驗室研究，所用二甲雙胍濃度顯著高于臨床糖尿病患者所用劑量，患者能否耐受如此大劑量二甲雙胍尚需大量的臨床試驗。