王麗美 肖 俐 支 敏 呂沛穎 高鵬飛 王永蘭

牙周炎，一類由多種因素引起的牙周組織的慢性進展性炎癥反應，在我國，成人牙周病的發(fā)病率高達80～90%[1]。牙周炎主要侵犯牙周支持組織，晚期牙周炎還影響患者的全身健康[2～4]。肥胖作為全球范圍內(nèi)的流行病，近10 年來已有大量的研究表明其與牙周炎具有相關(guān)性[5，6]。脂肪因子作為脂肪組織分泌的一類生物活性分子被人們廣泛研究，而其中脂聯(lián)素作為唯一負性調(diào)節(jié)的因子，可以促進脂肪酸的氧化，增加胰島素敏感性，在許多慢性炎癥疾病中發(fā)揮抗炎作用[7，8]。大量研究表明在牙周炎與肥胖相關(guān)疾病中均表征為低脂聯(lián)素血癥，而其相關(guān)機制仍不明確[9，10]。

細菌及其產(chǎn)物是牙周炎的主要始動因子，P.g作為細菌紅色復合體中最具代表性的一員，在牙周感染位點尤其是深牙周袋中含量升高而被廣泛研究[11]。P.g的致病原包括牙齦素、脂多糖等，脂多糖作為革蘭陰性細菌細胞外膜上一類最主要的大分子抗原，因其對牙周組織極高的毒性，而成為一類關(guān)鍵的毒力因子[12]。牙周組織的破壞包括牙槽骨和牙周軟組織的破壞，主要由炎癥介質(zhì)包括如IL-6 和PGE2，及組織破壞性酶包括如MMP-1 等介導。而TNF-α 等初級炎癥介質(zhì)可以誘導趨化因子向牙周組織聚集，加重結(jié)締組織的破壞和破骨細胞性骨吸收。目前關(guān)于脂聯(lián)素在牙周組織炎癥反應中的調(diào)控，大多數(shù)研究者著眼于脂聯(lián)素直接對牙周組織炎癥介質(zhì)的影響，如Dominik 的研究[13]表明，在口腔上皮細胞中，脂聯(lián)素降低了IL-1β 和IL-6 的表達，促進了IL-10 和血紅加氧酶-1 （heme oxygenase-1，HMOX1）表達。而關(guān)于脂聯(lián)素在牙周微生物致病方面起的調(diào)控作用目前國內(nèi)外研究甚少，有必要進一步深入研究。本實驗擬通過研究APN 對P.gLPS 刺激HGFs 分泌TNF-α、PGE2、IL-6 和MMP-1 的調(diào)控，探索脂聯(lián)素在牙周炎致病機制中所起的作用，從而為進一步揭示牙周炎與肥胖相關(guān)性的內(nèi)在機制提供依據(jù)。

資料和方法

一、材料

1.人牙齦成纖維細胞的培養(yǎng)及分組：選取自2017 年03 月至2017 年05 月因需要拔除埋伏阻生智齒在天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院頜面外科就診的患者共5 位（年齡18～24 歲，平均22 歲），排除患有全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等，妊娠，吸煙，近3個月內(nèi)使用抗生素史者，患者知情同意，在術(shù)中收集新鮮且色形質(zhì)正常、無明顯炎癥的的牙齦組織。運用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代HGFs 并進行傳代，當細胞傳至5 代時將細胞接至12 孔板進行實驗，隨機分為3 組，每組設(shè)置3 個復孔：①空白對照組，10%FBS 培養(yǎng)基；②2μg/mlP.gLPS+10%FBS 培養(yǎng)基刺激；③2μg/mlP.gLPS +1μg/ml APN+10%FBS 培養(yǎng)基刺激。

2.主要試劑及儀器：RT-PCR 試劑盒（sigma，美國）；引物（生工，上海）；P.gLPS（InvivoGen，美國）；APN（Peprotech，英國）。

二、方法

1.人牙齦成纖維細胞的培養(yǎng)與鑒定：運用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代人牙齦成纖維細胞進行傳代，顯微鏡下形態(tài)學觀察與細胞免疫細胞化學法-SP 法鑒定所培養(yǎng)的細胞為中胚層來源的人牙齦成纖維細胞，且不含上皮細胞。

2.P.gLPS 或聯(lián)合APN 刺激HGFs：取5 代HGFs 以1×105個/孔的密度均勻鋪在12 孔板上，于37℃，5% CO2溫箱孵育2 天使細胞貼壁融合至80%時，更換為1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培育1 天（這一步作為饑餓處理使牙齦成纖維細胞在刺激因素干預后產(chǎn)生足量的細胞因子），1 天后開始刺激實驗。根據(jù)組別在12 孔板每孔依次加入2μg/mlP.gLPS 2ml（以10%FBS 培養(yǎng)基為溶劑），4μg/mlP.gLPS 1ml+2μg/ml APN 1ml（均以10%FBS 培養(yǎng)基為溶劑），空白對照（10%FBS 培養(yǎng)基）2ml，每組設(shè)置3 個復孔，于37℃，5% CO2溫箱孵育24h，棄去培養(yǎng)液，在6h，8h，24h 提取HGFs 的總mRNA。

3.real-time PCR 檢測各組HGFs 中TNF-α、IL-6、PGE2、MMP-1 的表達：Trizol 提取人牙齦成纖維細胞總RNA，super RTcDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物序列如下：IL-6（162bp）（5’-CTCAATATTAGAGTCTCAACCCCCA-3’）和（5’- AGAAGGCAACTGGACCGAAG -3’），PGE2（163bp）（5’-AGGAGGGCGCATCTCTTTTC-3’）和（5’-CCAGTGCTATGAGGTTCCCC-3’），TNF-α（163bp）（5’-CTTCTCGAACCCCGAGTGAC-3）和（5’-ATGAGGTACAGGCCCTCTGA-3’），MMP-1（179bp）（5’-ATGCACAGCTTTCCTCCACT-3’）和（5’-ACTGGGCCACTATTTCTCCG-3’），95℃預變性約5min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35 個循環(huán)；72℃終延伸10min，循環(huán)閾值代表mRNA 數(shù)目，以β-actin 作為內(nèi)參，2-△△ct法處理數(shù)據(jù)，與對照組進行比較。

三、統(tǒng)計學分析

用IBM SPSS Statistics 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素ANOVA 方差分析（完全隨機設(shè)計），以P＜0.05 認為具有顯著性差異。

結(jié)果

1.HGFs 的培養(yǎng)與鑒定：運用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HGFs，3～4 天后可見組織邊緣隱約有成纖維細胞樣細胞游出，細胞極性較強，呈漩渦狀（圖1A）。當細胞匯合至80～90%時，進行首次傳代，隨培養(yǎng)時間和代數(shù)增加，細胞形態(tài)呈單一長梭型（圖1B）。免疫組化結(jié)果顯示：細胞抗波形蛋白染色陽性（圖2A），抗角蛋白染色陰性（圖2B），證實所培養(yǎng)的細胞為中胚層來源，并未混雜任何上皮源性細胞。

圖1 人牙齦成纖維細胞的培養(yǎng)

圖2 HGFs 組織來源的鑒定（免疫組織化學SP 法）

2.real-time PCR 檢測結(jié)果：①2μg/ml P.g LPS刺激HGFs 分泌PGE2、IL-6、MMP-1 及TNF-α：如圖3A、3B、3D 所示，在2μg/mlP.gLPS 刺激下HGFs 分泌PGE2、IL-6、TNF-α 在8h 時達峰值，以后逐漸減少，因此取8h 為進一步干預實驗PGE2、IL-6、TNF-α 的時間觀察點。如圖3C，MMP-1 分泌量在24h 內(nèi)隨時間遞減，因此取6h 為進一步干預實驗MMP-1 的時間觀察點。②各炎性介質(zhì)P.gLPS 最佳刺激點APN 對P.gLPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)的影響：如圖4A 所示，在8h，相較于空白對照組，P.g LPS 刺激組的PGE2 表達明顯上升（P＜0.05），APN 對P.gLPS 誘導的PGE2 表達上調(diào)起促進作用，但是無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），圖4B 所示在8h，相較于空白對照組，P.gLPS 刺激組的IL-6 明顯上升（P＜0.05），APN 明顯抑制這一過程，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4C 所示，在6h，相較于空白對照組，P.gLPS 刺激組的MMP-1 明顯上升（P＜0.05），APN 對P.gLPS 刺激的MMP-1 表達上調(diào)同樣起著抑制作用，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4D 所示，在8h，相較于空白對照組，P.gLPS 刺激組的TNF-α 明顯上升，APN 對這一過程起促進作用，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖3 不同時間點2μg/ml P.g LPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)A:PGE2，B:IL-6，C:MMP-1，D:TNF-α

圖4 APN 對P.g LPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)的影響P.g LPS:2μg/ml；APN:1μg/ml，A:PGE2，8h;B:IL-6，8h；C:MMP-1，6h；D:TNF-α，8h。*代表P.g LPS+10%FBS 組與10%FBS 組組間差異P＜0.05，**代表P.g LPS+APN+10%FBS 組與P.g LPS+10%FBS 組組間差異P＜0.05

討論

牙齦成纖維細胞在牙齦炎早期即可接觸到P.gLPS，在其上有Toll 樣受體4（Toll like receptor-4，TLR4）和Toll 樣受體2（Toll like receptor-2，TLR2）的表達，P.gLPS 與牙齦成纖維細胞細胞膜上的CD14 結(jié)合之后形成LPS-LBP-CD14 三體復合物，被轉(zhuǎn)運至TLR-MD-2，最終形成白介素受體相關(guān)激酶（interleukin receptor associated kinase，IRAK）/腫瘤壞死因子相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）復合體激活TRAF6，進而激活核因子（nuclear factor-κB，NF-κ B）和核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activated protein kinase-1，AP-1），游離的NF-κ B 被轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，激活下游基因，各炎性介質(zhì)隨之產(chǎn)生[14]。前期實驗證實2μg/mlP.gLPS 對HGFs 分泌目標因子作用最強（實驗數(shù)據(jù)尚未展示）。本實驗結(jié)果表明，在24h 內(nèi)，2μg/mlP.gLPS 刺激HGFs 分泌PGE2、IL-6、TNF-α 隨時間遞增，8h 達峰值，以后逐漸減少。IL-6 在0-8h 分泌量隨時間遞增，8h 達峰值，以后逐漸減少，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是：HGFs 后期產(chǎn)生大量的抑制因子IL-10 來抑制IL-6 的分泌。有研究表明該作用主要受轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B 的調(diào)控[15]。Malefyt 等[16]發(fā)現(xiàn)，在激活細胞后4-8h，單核細胞產(chǎn)生并分泌炎性因子IL-6，在8h 時才開始產(chǎn)生內(nèi)源性抗炎因子IL-10，到24～48h 達峰值。這合理解釋了8h 前IL-6 含量隨時間遞增，而在8h 達高峰后其表達反而隨時間下降。PGE2、TNF-α 和IL-6 的表達呈現(xiàn)了類似的趨勢，而MMP-1 的表達則不同，在6h 其表達為峰值，隨著時間遞減。有研究[17]表明，10ug/ml LPS 刺激HGFs 后，MMP-1 的表達量在受刺激后12h 內(nèi)逐漸增加，至12h 達峰值，以后逐漸減弱。也有研究[18]表明除中性粒細胞以外，大多數(shù)細胞在受刺激后的4-8h 即可合成基質(zhì)金屬蛋白酶，隨著時間延長，大部分MMP-1 被釋放至胞外，而胞內(nèi)貯存的較少，這合理解釋了本研究中隨著時間遞增，MMP-1 的表達量反而下降。在對牙周炎致病機理的探索中，不同的細胞因子間相互作用，這一復雜的相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)影響著牙周病的走向，為去除某些內(nèi)源性細胞因子的干擾及其他相關(guān)因素的干擾，更好研究APN 對這四種炎癥因子的調(diào)控作用，實驗對PGE2、IL-6 及TNF-α 選擇了8h 這一時間點，對MMP-1選擇了6h 這個時間點進行討論。本實驗表明，P.gLPS 作為牙周病的一類強致病物，可以促進牙齦成纖維細胞分泌產(chǎn)生大量的促炎因子和基質(zhì)降解酶，導致牙周軟硬組織的降解和炎癥的進一步惡化，這一點充分強調(diào)了病原微生物的致病作用在牙周炎癥、組織破壞過程中不可忽視。更為重要的是，本研究表明APN 顯著抑制P.gLPS 刺激HGFs 分泌炎癥因子如IL-6 及MMP-1，這與Dominik K 的研究[13]一致，他的研究以口腔上皮細胞為研究對象。目前有研究[19]表明，APN 發(fā)揮這一作用的可能機制是：在正常情況下，未活化的NF-κ B 與它的抑制蛋白IκB 結(jié)合以維持在胞質(zhì)中一定量的NF-κ B，而當IκB 磷酸化以及部分降解后，NF-κ B 被轉(zhuǎn)錄至細胞核內(nèi)，促進各種炎癥因子的表達。有研究[20]表明，APN 在與脂聯(lián)素受體1/脂聯(lián)素受體2（ adiponectin receptor1/ adiponectin receptor 2，AdipoR1/R2）上的COOH 末端結(jié)合后，富集大量的APPL1 接頭蛋白至脂聯(lián)素受體的NH2 末端，大量的APPL1 活化了腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）通路，而活化的AMPK 通路又會抑制IKK-NF-κ B 通路，因此，從這個意義上來說，APN 主要是通過減少NF-κ B 向核內(nèi)轉(zhuǎn)錄抑制LPS 誘導的炎癥因子表達，也有研究[19]認為APN 也可通過抑制ERK1/2 的活性來發(fā)揮這一作用，具體機制尚需進一步研究。本研究表明，在P.gLPS 刺激PGE2 表達的最佳誘導時間點，APN 對這一過程起促進作用，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而在非最佳誘導時間點，如6h 和24h，APN 抑制其表達（實驗數(shù)據(jù)未展示）。有研究[21]表明在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，APN 通過上調(diào)PGE2 表達發(fā)揮促炎作用，關(guān)于APN 對于PGE2 的表達調(diào)控存在爭議，仍需更多研究去證實。P.gLPS 刺激組的TNF-α 明顯上升，APN 對這一過程起促進作用，但數(shù)據(jù)并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而且在非最佳刺激時間點，如6h，APN 對其表達起抑制作用（實驗數(shù)據(jù)并未展示）。脂聯(lián)素形式多樣，大多數(shù)研究證實其作用大致類似，但仍有不少研究提示不同結(jié)果。Hong GP 研究組[22]用來自大腸桿菌和鼠骨髓瘤細胞重組的球狀APN 刺激牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)來自大腸桿菌的球狀APN 可促進炎性因子IL-6、IL-8 的分泌，多粘菌素B（一種LPS 的抑制劑）可以抑制這種作用，而來自小鼠骨髓瘤細胞的重組APN 卻沒有引起IL-6 和IL-8 的分泌增加，分析可能是前者混入有大腸桿菌脂多糖。本實驗選取的是來自于E.coli 提取的球狀APN，純度達99.5%，可排除因純度問題混入LPS。前期實驗證實2μg/mlP.gLPS 可以較強地促進HGFs 炎性因子的分泌，加入脂聯(lián)素這一干擾因素后，結(jié)果不可預測。本實驗時間和試劑濃度均基于Dominik K[13]的研究，同時結(jié)合預實驗來改良，但P.gLPS 刺激各炎性因子表達隨濃度、時間變化較大，結(jié)果復雜，在此主要討論P.gLPS 最佳刺激時間點APN 對其影響。P.gLPS作為一種高效的細胞因子誘導劑，可以刺激牙齦成纖維細胞合成分泌PGE2，IL-6，MMP-1 及TNF-α，在各炎性介質(zhì)最佳刺激時間點，APN 可抑制P.gLPS 刺激HGFs 分泌IL-6 及MMP-1，發(fā)揮抗炎、抗骨破壞和基質(zhì)降解作用，脂聯(lián)素與這些促炎因子相互作用，使相應的炎癥反應減弱，低脂聯(lián)素血癥很可能是聯(lián)系牙周炎與肥胖相關(guān)性的內(nèi)在因素之一。此結(jié)論仍然需要其他方面的研究進一步證實，從而增強結(jié)果的可靠性。