盧麗杰 俞靜佳 韋 瑜 吳婧怡 羅 勝 李 杏 范 玉 薛慶蕊 王天禹 任美思 孫宏晨 9306

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔頜面頭頸部最常見的惡性腫瘤，居全球惡性腫瘤第六位，容易發(fā)生侵襲和向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，近年來OSCC 的5 年生存率沒有明顯改善，因此闡明OSCC 發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)未來提高患者預(yù)后至關(guān)重要[1]。

白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞家族B（LILRB）是一類跨膜糖蛋白，為免疫抑制性受體[2]。LILRB1 是分布最廣泛的LILRBs，在NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、T 細(xì)胞亞群和B 細(xì)胞中均有表達(dá)[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)LILRB 的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，如在肺癌，胃癌，乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞中LILRB1 的表達(dá)上調(diào)[5]，可使癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力顯著增強(qiáng)，提示LILRB 可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞逐漸喪失上皮特性，上皮標(biāo)志物E-cadherin 和β-catenin 下調(diào)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間連接減弱和特定細(xì)胞表面標(biāo)志物喪失[6，7]。同時(shí)細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型，即間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物 Vimentin，F(xiàn)ibronectin 和N-cadherin 上調(diào)，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[8]。EMT在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用[9]。

目前，國內(nèi)外尚無LILRB1 在口腔癌中表達(dá)的相關(guān)研究，本研究擬的目標(biāo)是探究口腔鱗狀細(xì)胞癌中LILRB1 的表達(dá)及其與EMT 的關(guān)系，為預(yù)防口腔癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。

資料和方法

1.組織標(biāo)本：收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院病理科2018～2019 年期間OSCC 患者20 例，其中10 例為高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌；10 例為低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌。同時(shí)收集10 例正?？谇火つず?0 例異常增生黏膜標(biāo)本作為正常對(duì)照，相關(guān)的組織標(biāo)本均經(jīng)過病理科鑒定，并經(jīng)過患者知情同意及倫理委員會(huì)許可。

2.主要試劑：兔抗人LILRB1 單克隆抗體（EPR11256，1：200，Abcam）；兔抗人E-cadherin 和Vimentin 單克隆抗體 （ZA-0565，ZA-0260，北京中山金橋）；即用型免疫組化UltraSensitive TM SP 試劑盒（鼠/兔）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

3.免疫組織化學(xué)染色：除切片和封片外，所有步驟均在Autostainer 480-Lab VisionTM自動(dòng)染色機(jī)上完成。具體步驟如下：取材、固定、石蠟包埋，連續(xù)4μm 切片?？酒妆矫撓?，梯度酒精水化，自來水沖洗10 分鐘，PBS 沖洗。EDTA 溶液高溫?zé)嵝迯?fù)20 分鐘，自然冷卻，PBS 清洗沖洗。3%過氧化氫室溫孵育10 分鐘，PBS 沖洗，血清封閉。滴加一抗LILRB1、E-cadherin 和Vimentin 常溫孵育1 小時(shí)45分鐘，PBS 沖洗。滴加二抗37℃恒溫孵育30 分鐘，PBS 洗片。DBA 顯色5-10 分鐘。蘇木素復(fù)染，封片。晾干后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)、圖像采集并保存。

4.免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：E-Cadherin 判定方法：每例切片隨機(jī)選取五個(gè)視野進(jìn)行拍攝。運(yùn)用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行圖像信息分析，設(shè)置平均灰度值為主要參數(shù)，其中平均灰度值＞177 為陰性，＜177 為陽性。Vimentin 和LILRB1 判定方法：由兩名計(jì)數(shù)者雙盲進(jìn)行閱片。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞所占比例綜合評(píng)分。Vimentin：無黃染為0 分，輕度黃染1 分，中度黃染2 分，重度黃染3 分；陽性細(xì)胞＜5%為0 分，5%～＜25%為1 分，25%～＜75%為2 分，≥75%為3 分。LILRB1：無染色為0 分，輕度黃染1 分，重度黃染2 分；陽性細(xì)胞≤20%為0分，20%～40%為1 分；40%～80%為2 分；＞80%為3分。每例綜合評(píng)分為上述兩個(gè)評(píng)分的乘積。0～2 分為陰性，＞2 分為陽性。

5.統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher 確切概率法，變量間相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.LILRB1 與EMT 標(biāo)記物在口腔鱗癌及正常上皮黏膜中的表達(dá)：在口腔鱗癌組織中，LILRB1 主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿中，少量位于腫瘤間質(zhì)中；E-Cadherin 蛋白主要定位于細(xì)胞膜上；Vimentin 蛋白主要位于細(xì)胞漿中，見圖1。LILRB1 在口腔癌組織中陽性表達(dá)率為65.00%（13/20），在正常上皮組織中陽性率為0.00%（0/20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；口腔鱗癌組織中E-Cadherin 蛋白的表達(dá)（20.00%，4/20）顯著低于對(duì)照組（70%，14/20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.004）；Vimentin 在口腔鱗癌組織中的表達(dá)（100.00%，20/20） 顯著高于對(duì)照組（50%，10/20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），見表1。

圖1 免疫組化法檢測LILRB1 與EMT 標(biāo)記物在口腔鱗癌及正常上皮黏膜中的定位及表達(dá)（×200）

2.E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系：E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 的表達(dá)與口腔鱗癌患者性別、年齡、分化程度和淋巴結(jié)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性轉(zhuǎn)移情況，見表2。

3.LILRB1 與EMT 標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性分析：Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，在口腔癌組織中LILRB1 的表達(dá)與E-Cadherin 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.628，P＝0.000），即隨著LILRB1 表達(dá)的陽性率增高，E-cadherin 的蛋白呈降低趨勢；與Vimentin 的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.401，P＝0.010），即LILRB1 蛋白表達(dá)的越多，Vimentin 的陽性率越高，見表3。

表1 E-cadherin、Vimentin 和LILRB1 在口腔鱗癌及正常上皮組織中的表達(dá)比較

表2 E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 表達(dá)與口腔鱗癌臨床參數(shù)的關(guān)系

表3 LILRB-1 與EMT 標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性分析

討論

近年來口腔鱗癌的發(fā)病率逐漸增高，經(jīng)過手術(shù)及放化療后其5 年生存率可達(dá)60%。但是口腔鱗癌容易復(fù)發(fā)及向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期發(fā)現(xiàn)的癌癥患者生存率只有30%左右[10]。目前，影響OSCC 轉(zhuǎn)移的因素和機(jī)制尚不明確。EMT 是指在生理或病理?xiàng)l件下上皮細(xì)胞逐漸向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，其在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。在此過程中，腫瘤細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間彼此連接疏松，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)，上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，容易向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。E-cadherin 和Vimentin 是EMT 相關(guān)的重要標(biāo)志物，本研究檢測了40 例組織標(biāo)本中E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)。OSCC 中E-cadherin 的表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)；間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 的表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，表明部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。這與Jingping Zhou 和Soussan Irani 等人的研究報(bào)道吻合[12，13]。

LILRB1 屬于免疫抑制性受體，主要在NK 細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，可以通過多種方式抑制免疫反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[14]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細(xì)胞中也可表達(dá)LILRB1[15～17]。Pei Zhang 等人發(fā)現(xiàn)LILRB1 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)增加[18]；另外胃癌組織和乳腺癌組織中也有不同程度的LILRB1 表達(dá)[17]，且異常高表達(dá)的LILRB1 與癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，可促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC 中LILRB1 的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且主要分布在腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在間質(zhì)微環(huán)境內(nèi)僅有少量表達(dá)。

LILRB1 與EMT 的關(guān)系目前尚未有人報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，LILRB1 表達(dá)的增加與E-cadherin、Vimentin 表達(dá)的改變存在相關(guān)性，即LILRB1 與E-cadherin 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin 的表達(dá)改變呈正相關(guān)，提示LILRB1 可能參與EMT 的發(fā)生。這也提示LILRB1 也許可以作為新的靶點(diǎn)，為以后的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。LILRB1 影響口腔癌EMT 發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。