郝學(xué)明，王響鈴，宋柏權(quán)，王孝純，王秋紅，周建朝

（黑龍江大學(xué)/黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris)是黎科甜菜屬作物，是世界上僅次于甘蔗的第二大重要的糖料作物[1]。甜菜糖占世界食糖產(chǎn)量的30%左右，在世界產(chǎn)糖大國(guó)中，中國(guó)是美國(guó)、日本、埃及、西班牙等少數(shù)既產(chǎn)甜菜糖又產(chǎn)甘蔗糖的國(guó)家之一[2]。中國(guó)甜菜種植主要分布在東北、西北和華北地區(qū)，在中國(guó)北方農(nóng)業(yè)與制糖業(yè)發(fā)展和農(nóng)民增收等方面具有不可代替的作用[3]。甜菜是一種糖料作物，光合作用是甜菜塊根產(chǎn)糖量形成的重要影響因素，甜菜塊根產(chǎn)量中90%～95%的有機(jī)質(zhì)是由光合作用固定并轉(zhuǎn)化的[4]。植物光合利用率主要取決于葉片葉綠素含量的多少，可以通過(guò)測(cè)定葉片中的葉綠素含量來(lái)鑒定其營(yíng)養(yǎng)狀況[5]。因此，測(cè)定甜菜葉綠素含量對(duì)分析甜菜葉片光合能力、預(yù)測(cè)甜菜塊根產(chǎn)糖有具有重要意義。

目前測(cè)定葉綠素含量的方法主要有2 種，一種是化學(xué)提取分光光度計(jì)比色法，另一種是SPAD(Soil and Plant Analyzer Development)葉綠素儀法[6]。SPAD-502葉綠素儀可快速測(cè)量植物葉片單位面積葉片當(dāng)前葉綠素的相對(duì)含量，即SPAD值[7]。采用葉綠素儀測(cè)定葉片的SPAD值具有便攜、實(shí)時(shí)和對(duì)葉片無(wú)損的優(yōu)點(diǎn)。在棉花[8]、小麥[9-10]、水稻[11-12]、油菜[13]等作物[14]及果樹(shù)[15]和園林樹(shù)木[16]中均有廣泛應(yīng)用。研究表明，葉綠素在植株葉片中的分布會(huì)因物種、測(cè)定時(shí)期、測(cè)定位置的不同而異。不同植物及同一植物的不同品種利用SPAD值來(lái)預(yù)測(cè)葉片葉綠素含量均存在一定差異，同一植株葉片上的SPAD值表現(xiàn)出葉尖部＞葉中部＞葉基部的特點(diǎn)[17-18]。而分析甜菜葉片葉綠素含量與SPAD值相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文利用分光光度計(jì)和SPAD葉綠素儀測(cè)定不同甜菜品種的葉綠素含量，研究甜菜葉片的葉綠素含量和SPAD值的相關(guān)關(guān)系，確定適宜的SPAD值測(cè)定位置，旨在為SPAD-502葉綠素儀測(cè)定法計(jì)算甜菜葉片的葉綠素含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜菜品種‘KWS1197’、‘KWS5145’、‘KWS0143’源于德國(guó) KWS 公司，‘ВETA165’源于美國(guó)Вeta公司，4個(gè)品種均為二倍體遺傳單粒種。

水培用盆為聚乙烯塑料盆(24 cm× 17 cm×16 cm)，水培化學(xué)試劑同常規(guī)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水培試驗(yàn)于2018年4月4日—5月16日在國(guó)家糖料改良中心/黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS5145’、‘KWS0143’甜菜種子播種于經(jīng)過(guò)180℃高溫消毒4.5 h 的蛭石中，澆適量去離子水，進(jìn)行催芽。1 周后（待甜菜子葉完全展開(kāi)）4 個(gè)品種均選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移入1/4全量營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)。首先用1/4濃度全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1周，然后用1/2濃度全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5天，之后全量營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)25天進(jìn)行收獲，期間營(yíng)養(yǎng)液每5 天更換1 次。光照時(shí)間為7:30—19:30，每天光照12 h，通氣12 h。每品種種植 8 盆，每盆 2 株，共 32 盆，隨機(jī)區(qū)組排列。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1SPAD值的測(cè)定 使用SPAD-502型葉綠素計(jì)測(cè)定最新完全展開(kāi)葉片的葉尖、葉中和葉基3 個(gè)部位的SPAD值，每部位讀取10個(gè)值，每片葉共30個(gè)值。

1.3.2 光合色素含量的測(cè)定 光合色素含量的提取采用乙醇法[19]，在測(cè)定SPAD值的葉片相應(yīng)位置，即葉片的葉尖、葉中和葉基3 個(gè)部位分別用直徑10 mm 打孔器打孔，取3個(gè)圓形葉片，用分析天平稱重后放于25 mL試管，用10 mL95%乙醇避光浸泡24 h，浸泡過(guò)程中混勻多次，待葉片完全變白后進(jìn)行比色。光合色素測(cè)定采用分光光度法，利用UV-8000A紫外分光光度計(jì)，用波長(zhǎng)665、649、470 nm分別測(cè)量吸光度值，并換算為單位質(zhì)量葉綠素含量，見(jiàn)公式(1)～(4)。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以及部分圖表的制作和統(tǒng)計(jì)分別利用Excel 2010軟件和SPSS 22.0制作

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜品種間SPAD值差異分析

如圖 1～4 所示，4 個(gè)甜菜品種SPAD值存在差異，‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS0143’、‘KWS5145’葉片平均SPAD值 ，‘KWS1197’最大 ，‘KWS5145’最小。在同一品種葉片不同測(cè)定位置上，‘ВETA165’SPAD值表現(xiàn)出葉基＞葉中＞葉尖的特點(diǎn)，越靠近葉片基部，SPAD值越大?！甂WS0143’則表現(xiàn)出完全相反的特點(diǎn)，即葉尖＞葉中＞葉基，越靠近葉片基部，SPAD值越小?！甂WS1197’、‘KWS5145’2 個(gè)品種均是葉中值較小，‘KWS1197’葉片不同測(cè)定位置SPAD值趨于穩(wěn)定?！TA165’、‘ KWS1197’葉基部SPAD值最大，‘KWS5145’和‘KWS0143’則是葉尖SPAD值最大。總體比較甜菜葉片中部的SPAD值與平均值最為接近。SPAD值在甜菜葉片中的分布不僅與測(cè)定的位置（葉尖、葉中、葉基）有關(guān)，還與測(cè)定的甜菜品種有關(guān)。

圖1 ‘BETA165’葉片SPAD值

圖2 ‘KWS1197’葉片SPAD值

圖3 ‘KWS5145’葉片SPAD值

圖4 ‘KWS0143’葉片SPAD值

2.2 甜菜品種間葉綠素總含量差異分析

如圖5～9所示，同一葉片的葉綠素總含量，測(cè)量位置不同其含量也有差異?！TA165’與‘KWS5145’趨勢(shì)一致，均是葉基＞葉中＞葉尖，不同測(cè)量位置差異顯著。‘KWS1197’葉尖、葉中、葉基葉綠素含量差異較小，趨于平穩(wěn)?！甂WS0143’葉尖的葉綠素總含量最多，而越靠近葉基部含量越少，從葉尖到葉基含量從1.94 mg/g 下降到1.77 mg/g。而各品種在葉中的葉綠素含量最接近均值，具有一定的代表性，這一規(guī)律與不同測(cè)量位置的SPAD值一致。在甜菜品種之間葉綠素含量葉存在差異。葉片中葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量均表現(xiàn)一致的趨勢(shì) ，‘ВETA165’ ＞‘KWS1197’ ＞‘KWS0143’ ＞‘KWS5145’，這與品種間SPAD值的表現(xiàn)趨勢(shì)類似。在甜菜葉片中，葉綠素a 含量較高，平均1.38 mg/g，占葉綠素總含量的73%，其次為葉綠素b，而葉片中類胡蘿卜素含量較低，平均0.25 mg/g。甜菜葉片中葉綠素含量的分布規(guī)律與SPAD值一致，不僅與測(cè)定的位置（葉尖、葉中、葉基）有關(guān)，而且與測(cè)定的甜菜品種有關(guān)。

圖5 ‘BETA165’葉片不同部位葉綠素總含量

圖6 ‘KWS1197’葉片不同部位葉綠素總含量

圖7 ‘KWS5145’葉片不同部位葉綠素總含量

圖8‘KWS0143’葉片不同部位葉綠素總含量

圖9 甜菜不同品種葉片葉綠素含量

2.3 甜菜葉片SPAD值及葉綠素含量相關(guān)性分析

如圖10所示，甜菜葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜含量與SPAD值做回歸統(tǒng)計(jì)分析。甜菜光合色素含量與SPAD值呈正向相關(guān)。葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.7208、0.7763、0.7766、0.5704。

圖10 甜菜SPAD值與光合色素含量的相關(guān)性

不同品種甜菜葉片中光合色素含量和SPAD值均有差異，但是品種之間葉片的SPAD值與光合色素含量的變化趨勢(shì)整體上保持一致?？?cè)~綠素含量與SPAD值的相關(guān)性最高，r=0.7766；葉綠素 a、b 含量與SPAD值的相關(guān)性次之；類胡蘿卜素與SPAD值的相關(guān)性最低，r=0.5704。

3 結(jié)論與討論

采用葉綠素儀測(cè)定葉片的SPAD值具有便攜、實(shí)時(shí)和對(duì)葉片無(wú)損的優(yōu)點(diǎn)。尤其在大田條件下SPAD-502葉綠素儀可在無(wú)損狀況下幾秒鐘內(nèi)測(cè)量植物葉片單位面積葉片當(dāng)前葉綠素的相對(duì)含量，大大提高了效率。SPAD值與葉綠素含量相關(guān)性研究在其他作物上已有大量報(bào)道[20]，但在甜菜葉片及葉片上適宜的測(cè)量部位的研究涉及較少。本試驗(yàn)探討了甜菜葉片上不同測(cè)量部位的SPAD值及相應(yīng)的葉綠素含量，確定了SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性及適宜的測(cè)量部位，以便更加準(zhǔn)確快速地反映甜菜葉片的葉綠素含量。

在甜菜葉片中，不同品種的SPAD值及葉綠素含量在測(cè)量位置上存在差異，‘ВETA165’、‘KWS1197’在葉基部葉綠素含量較高，葉尖較低，而‘KWS5145’、‘KWS0143’在葉尖部葉綠素含量較高，葉基部較低。研究結(jié)果表明，甜菜葉片的葉中部最接近平均值，因此，在測(cè)定甜菜葉片葉綠素含量與SPAD值時(shí)，選取葉中部進(jìn)行測(cè)定具有一定的參考意義。陳琴等[15]對(duì)牧草的研究發(fā)現(xiàn)，葉中部的SPAD值更接近平均值，可以作為試驗(yàn)?zāi)敛軸PAD值測(cè)定的適宜部位，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)甜菜4～6片真葉期后最高葉片的葉片尖部可作為甜菜葉片SPAD值的最適測(cè)定部位[21]。潘義宏等[17]對(duì)煙葉的研究發(fā)現(xiàn)，采用葉綠素儀來(lái)測(cè)定葉片最佳部位會(huì)因品種而異。葉綠素含量在葉片3個(gè)部位存在差異可能是植物葉肉組織成熟程度的差異造成的。SPAD值會(huì)受到不同品種、不同測(cè)定時(shí)間、不同的生長(zhǎng)環(huán)境等因素的影響[6,22-23]。

筆者使用SPAD-502 葉綠素儀測(cè)定葉綠素的相對(duì)含量，分光光度法測(cè)定葉綠素絕對(duì)含量，通過(guò)對(duì)甜菜SPAD值與葉綠素含量比較發(fā)現(xiàn)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素及SPAD值在不同甜菜品種間有一定的差異。同時(shí)在甜菜葉片中葉綠素a 含量＞葉綠素b 含量＞類胡蘿卜素含量。這一結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[24]。對(duì)葉綠素含量與SPAD值進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SPAD值與葉綠素含量呈正相關(guān)，這一結(jié)果與水稻、小麥等作物[25]及綠色蔬菜[26]、果樹(shù)[27]等的研究結(jié)果相似。其中總?cè)~綠素含量與SPAD值的相關(guān)性最高，r=0.7766，葉綠素a、b含量與SPAD值的相關(guān)性次之，而類胡蘿卜素與SPAD值的相關(guān)性最低，r=0.5704。

綜上所述，通過(guò)SPAD值來(lái)預(yù)測(cè)甜菜葉片葉綠素的絕對(duì)含量是可行的，為葉綠素的快速測(cè)定提供了便利，但是SPAD值會(huì)受到多種因素的影響，代表的是葉綠素的相對(duì)水平，在實(shí)際生產(chǎn)中若是要求植株確切的葉綠素含量，還需用傳統(tǒng)的分光光度法。而本試驗(yàn)的甜菜品種較少，若測(cè)定不同品系的多個(gè)甜菜品種其相關(guān)性會(huì)更加精確。對(duì)于SPAD值和不同品種甜菜氮含量、產(chǎn)量、含糖量的關(guān)系還待于下一步研究。