唐世倩 褚春芳 李 婷 鄭 萍 周 琦 劉菊紅 王 玉

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，北京 100026

非典型子宮內(nèi)膜增生（atypical endometrial hyperplasia，AEH）疾病被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，在雌激素持續(xù)作用下，最終可進(jìn)展為子宮內(nèi)膜癌[1]，目前AEH 的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)，AEH 疾病存在著多種基因的異常表達(dá)，提示AEH 是由多種基因共同參與的、復(fù)雜的生物演變過程[2]。

微小RNA（microRNA，miRNA)是一種小分子RNA，它可通過影響目標(biāo)mRNA 的穩(wěn)定性及翻譯，參與細(xì)胞周期、分化、生長、新陳代謝等多個生物過程的調(diào)控[3]，現(xiàn)已證實多種miRNA 參與機(jī)體內(nèi)腫瘤的形成，并發(fā)揮巨大調(diào)節(jié)作用，但其在AEH 中的作用目前尚不清楚。為了探索miRNA 在AEH 中的作用，本研究采用高通量測序技術(shù)篩選正常人群與AEH 患者子宮內(nèi)膜的差異miRNA，并進(jìn)行生物學(xué)分析，了解差異miRNA 在AEH 中作用及機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年1 月～2017 年1 月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的3 例AEH患者（實驗組）及3 名正常女性（對照組）的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，年齡25～40 歲。實驗組平均年齡（36.33±1.86）歲，平均體重指數(shù)（BMI）（24.31±1.42）kg/m2；對照組平均年齡（30.00±2.89）歲，平均BMI（18.25±1.36）kg/m2。兩組年齡、BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

實驗組樣本選自經(jīng)診斷性刮宮術(shù)，術(shù)后病理證實為AEH 內(nèi)膜組織的患者；對照組樣本選自同期行診斷性刮宮術(shù)，術(shù)后病理證實為正常增生期子宮內(nèi)膜的女性。所有研究對象既往均未使用激素藥物治療，且無甲狀腺、子宮肌瘤、惡性腫瘤、糖尿病、多囊卵巢綜合征等病史。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

用生理鹽水洗滌兩組診斷性刮宮術(shù)后得到的內(nèi)膜組織標(biāo)本，置EP 管中，液氮快速冷凍后，-80℃冰箱保存待測。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果挑選符合要求的組織標(biāo)本，將實驗組與對照組配對。

1.2.1 總RNA 提取及文庫構(gòu)建 總RNA 提取及文庫構(gòu)建由深圳華大基因科技有限公司完成。取適量組織樣品研磨后，加1.5 mL TRIzol 裂解液，放入組織研磨機(jī)（TissueLyser Ⅱ）中研磨30 s，使組織細(xì)胞充分裂解，12000 g 離心5 min（4°C），取上清液，抽提純化樣品的總RNA。采用安捷倫2100 芯片生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）評估總RNA，NanoDrop Lite分光光度計(賽默飛世爾科技公司)檢測A260/A280 的總RNA 純度。將檢驗合格的總RNA 采用small RNA文庫構(gòu)建試劑盒TruSeq Small RNA Library Prep Kit（illumina，貨號：RS-200-0012）進(jìn)行文庫構(gòu)建。取200～1000 ng RNA 樣品，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離不同大小的RNA 片段，收集18～30 nt 之間的RNA條帶。根據(jù)small RNA 文庫構(gòu)建試劑盒在RNA 3′、5′端接上接頭，通過與3′端互補(bǔ)的逆轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：70℃2 min，50℃1 h。PCR 擴(kuò)增程序：98℃30 s；98℃10 s，60℃30 s，72℃15 s，11 個循環(huán)；72℃10 min；4℃保持。使用PAGE 對PCR 產(chǎn)物切膠回收純化，回收產(chǎn)物溶于溴化乙錠（EB）中，構(gòu)建small RNA 文庫。采用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測small RNA 文庫，經(jīng)測序平臺（Illumina HiSeq-4000）對該文庫進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 miRNA 信息分析 處理原始數(shù)據(jù)：過濾低質(zhì)量讀數(shù)，如去除長度小于18 nt 的片段、去除5′和3′端口質(zhì)量連續(xù)低于10 的堿基及含有＞10% N 堿基的讀數(shù)等。將處理后的序列運用序列拼接工具bowtie 定位到人類基因組，通過對比分析，去除與基因組不匹配的序列。再將匹配序列分別與基因組重復(fù)序列Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫和Rfam 10.0 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，篩選和去除其他小分子RNA 序列，剩余序列應(yīng)用Blast 和miRbase 21.0 數(shù)據(jù)庫比對，鑒定已知的miRNA。對存在于人類基因組外顯子反義鏈、內(nèi)含子、基因間區(qū)，但未確定的sRNA 而言，通過Mirdeep 篩選miRNA 的生物特征得到新的miRNA，將鑒定出已知和預(yù)測的新miRNA 用于后續(xù)分析。

1.2.3 已知miRNA 差異表達(dá)分析 應(yīng)用DEGseq 軟件對已知的miRNA 進(jìn)行表達(dá)分析，閾值為|log FC|＞2、qvalue＜0.001，篩選出有顯著性差異的miRNA。對差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行Venn 分析，篩選3 組或2 組間有交集的miRNA 作為差異表達(dá)，進(jìn)入下游分析。

1.2.4 miRNA 的功能分析 用miRWalk 2.0、miRanda、PITA、RNAhybrid 和Targetscan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的靶基因，使用R 包clusterprofiler 進(jìn)行KEGG 富集分析。使用BH（Benjamini 和Hochberg）法校正P 值，以P＜0.05 為截止值。

1.2.5 miRNA 之間相互作用 若兩miRNA 共同調(diào)控同一靶基因，則該靶基因為兩miRNA 共調(diào)控靶基因，對共同調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO Biological Process 富集分析，并根據(jù)富集到的條目數(shù)量來量化miRNA 之間功能協(xié)同作用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 small RNA 文庫表達(dá)情況

實驗組和對照組經(jīng)高通量測序分別得到45 446 485 和46 115 154 條原始序列，數(shù)據(jù)處理后，得到的序列分別為44 418 630 及45 097 769 條。

2.2 miRNA 及相應(yīng)靶基因情況

通過軟件分析及比對，實驗組得到284 個已知miRNA 及1925 個新miRNA；對照組得到409 個已知miRNA 及2314 個新miRNA，進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測其相應(yīng)的靶基因。見表1。

表1 miRNA 及相應(yīng)靶基因情況

2.3 差異miRNA 分析

結(jié)果顯示，在閾值為|log FC|＞2，qvalue＜0.001的條件下，得到3 組（346、66、11 個）差異miRNA，下游分析共獲得18 個miRNA，其中17 個為上調(diào)miRNA，包括：hsa-miR-375、hsa-miR-1307-5p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-1247-5p、hsa-miR-340-3p、hsamiR-100-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-3909、hsamiR-431-5p、hsa-miR-1247-3p、hsa-miR-4454、hsamiR-182-5p、hsa-miR-4286、hsa-miR-577、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-4485；1 個為表達(dá)下調(diào)miRNA，hsa-miR-3609。

2.4 差異miRNA 靶基因的富集分析

每個miRNA 的靶基因功能富集和通路分析結(jié)果見圖1（封四），富集因子點越大表示富集程度越高，通路中候選靶基因個數(shù)越多。

圖1 差異miRNA 靶基因的富集分析

2.5 差異miRNA 共調(diào)控靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

結(jié)果顯示，miRNA 之間共調(diào)控靶基因共有18 個節(jié)點，107 個關(guān)系對。miR-4286、miR-577、miR-182-5p 等miRNA 之間有較多、緊密的功能協(xié)同作用，分別調(diào)控1493、3455、2864 個靶基因，共同調(diào)節(jié)CACNA1C、MECP2、FOXK1、LPP、SH3TC2、Smad、MDM4 等靶基因，見圖2。直線代表兩miRNA 之間的共調(diào)控靶基因存在顯著的GO Biological Process 富集結(jié)果，其粗細(xì)代表富集結(jié)果數(shù)目。

圖2 差異miRNA 共調(diào)控靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

近年來，AEH 的發(fā)病率呈上升趨勢，越來越受關(guān)注。臨床上對無生育要求的AEH 患者可行全子宮切除術(shù)，但對于有生育要求的女性而言，可連續(xù)服用大劑量、高效的孕激素[4]或選擇放置左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)（LNG-IUS）[5]抑制內(nèi)膜增生，同時口服二甲雙胍等[6]輔助治療，但是部分患者的治療效果并不滿意。隨著人們對疾病逐漸深入了解，認(rèn)識到AEH 不僅是腫瘤相關(guān)性疾病，而且還與機(jī)體糖耐量降低、糖尿病、中心性肥胖、內(nèi)分泌異常等多種代謝異常疾病相關(guān)。

miRNA 是一類包含19～25 個堿基的內(nèi)源性RNA，主要通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA 相關(guān)靶基因，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及個體發(fā)育。miRNA 具有高度保守性，自身不翻譯蛋白質(zhì)[7-8]，但在生物體內(nèi)可以通過多種代謝途徑發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，例如miR-1202 降低或miR-196a 升高影響AN3CA 和HEC-1-A 細(xì)胞增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[9]；miR-21、miR-205 通過下調(diào)PTEN、程序性凋亡基因4 等基因表達(dá)水平，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞增殖[10]；miR-106b-93-25 調(diào)節(jié)p21 和BIM，減少子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡[11]。然而，目前miRNA 在AEH 中的研究較少。近期有報道顯示，miR-205、miR-146a、miR-1260b 可作為分子標(biāo)志物來鑒定AEH 和典型子宮內(nèi)膜增生[12]，因此miRNA 可能在不同子宮內(nèi)膜狀態(tài)轉(zhuǎn)化間發(fā)揮作用。

本實驗采用測序速度快、準(zhǔn)確度高的高通量測序技術(shù)檢測AEH 與正常子宮內(nèi)膜組織miRNA 的差異性。研究中分別提取3 例正常子宮內(nèi)膜組織及3 例AEH 組織的總RNA 并進(jìn)行文庫構(gòu)建，分析各樣品中的miRNA 及靶基因情況。通過分析共篩選出18 種具有明顯差異的miRNA，其中上調(diào)17 個，下調(diào)1 個。為進(jìn)一步明確其在機(jī)體內(nèi)的功能，對篩選出的具有顯著差異的miRNA 進(jìn)行靶基因功能富集和通路分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異性miRNA 的靶基因大部分富集在腫瘤或者機(jī)體代謝的信號傳導(dǎo)相關(guān)通路上，意味著這些具有差異的miRNA 可能通過激活腫瘤及機(jī)體代謝途徑對靶基因發(fā)揮作用。這與目前已知的AEH 發(fā)生機(jī)制相符，說明AEH 不單是一種腫瘤相關(guān)的病變，機(jī)體代謝性異常可能也參與AEH 疾病的發(fā)展。

通過構(gòu)建差異miRNA 之間的作用網(wǎng)，分析差異miRNA 共同調(diào)控的靶基因，作用網(wǎng)顯示miR-577、miR-182-5p、miR-4286 相互之間有著密切關(guān)系。且這三種miRNA 已經(jīng)被證實分別在多種腫瘤及機(jī)體代謝疾病中發(fā)揮重要的作用。miRNA-182-5p 在前列腺癌[13]、胃癌[14]，miR-4286 在非小細(xì)胞肺癌[15]、食管癌[16]，miR-577 在胃癌[17]等腫瘤中均有表達(dá)。靶向調(diào)控相應(yīng)靶基因，激活并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力。通過對miR-577、miR-182-5p、miR-4286 進(jìn)行靶基因預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均可通過調(diào)節(jié)Smad 發(fā)揮作用。而Smad 被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)靶點[18]，且有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182-5p 在膀胱癌組織中可以靶向作用于Smad 4 發(fā)揮致癌作用[19]。但是到目前為止，尚未有研究這三種miRNA 在AEH 中的調(diào)節(jié)機(jī)制，由此提示需要進(jìn)行后期驗證，進(jìn)一步確定miR-577、miR-182-5p、miR-4286 與Smad 4 之間是否存在調(diào)節(jié)關(guān)系。

差異miRNA 的靶基因功能富集和通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-577、miR-4286 的靶基因均與AMPK 信號通路相關(guān)。AMPK 信號通路是體內(nèi)中樞代謝轉(zhuǎn)換的重要途徑，且AMPK 已被確認(rèn)是糖尿病患者的治療靶點[20]。在AEH 中，miR-577、miR-4286 是否通過AMPK 信號通路發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步研究。另外，成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF-21）水平的降低可能與糖尿病發(fā)生具有相關(guān)性，此前Chen 等[21]發(fā)現(xiàn)miR-577 可通過負(fù)向調(diào)節(jié)FGF-21 影響機(jī)體內(nèi)的血糖及血脂水平。由此可見，miR-577、miR-4286 可能通過機(jī)體的代謝途徑參與AEH 的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過高通量測序技術(shù)檢測到AEH 和正常子宮內(nèi)膜組織中差異的miRNA，通過對差異miRNA 進(jìn)行生物學(xué)分析，了解差異miRNA 在AEH 中可能發(fā)揮的作用和機(jī)制。然而，由于本試驗中檢測樣本數(shù)量較少，使得試驗存在一定的局限性，還有待于在大量的組織樣本中進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，以便更好地了解miRNA 在AEH 中的作用機(jī)制。