黃 敏 陶星宇 賈寶輝 楊少龍 徐春鳳

1.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330000；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330003；3.河南省天然藥物提取和醫(yī)療技術(shù)應(yīng)用工程中心，河南鄭州 451460；4.鄭州市重癥感染、創(chuàng)傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450007；5.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，河南鄭州 450052

膿毒癥（Sepsis）是指感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，可產(chǎn)生危及生命的器官功能損害。目前其臨床機(jī)制還不十分清楚，臨床上多認(rèn)為是由細(xì)菌感染激發(fā)的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的相互作用進(jìn)而造成全身各系統(tǒng)、器官的損傷[1]。心臟和肺作為機(jī)體重要的器官，在膿毒癥受累的臟器中比較常見。近些年已有相關(guān)研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膿毒癥造成的重要器官損傷的發(fā)生中具有重要作用[2]。姚詠明等[3]提出在膿毒癥的發(fā)病過程中，各種刺激均可影響細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能狀態(tài)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激本身能參與機(jī)體各器官功能的損傷，其反應(yīng)狀態(tài)對(duì)調(diào)控膿毒癥病理進(jìn)程具有重要影響。膿毒癥可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的激活又參與膿毒癥組織器官的壞死[4]。伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記性蛋白，而凋亡蛋白caspase-12 通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，兩者都能作為具有特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的相關(guān)蛋白。

本研究通過檢測(cè)膿毒癥小鼠重要器官GRP78 及caspase-12 的表達(dá)，觀察人參皂苷對(duì)膿毒癥小鼠是否具有保護(hù)作用以及探討其可能的保護(hù)機(jī)制是否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雌性小鼠60 只（4～6 周齡C57BL/6，飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃，濕度50%～60%。購(gòu)于三峽大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK（鄂）2017-0012），體重25～30g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)待和照顧嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[5]，并經(jīng)過鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)審批。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假盲腸結(jié)扎并穿孔（CLP）組、人參皂苷組、CLP組，每組15 只。

1.2 主要試劑及儀器

注射用人參皂苷Rb1（50 mg/支，批號(hào)：110704-201827，上海源葉生物科技有限公司），30%丙烯酰胺（批號(hào)：680853295，北京索萊寶生物科技有限公司），小鼠單抗β-actin（批號(hào)：ah01032107，武漢博士德生物工程有限公司），兔多抗grp78（70～78 kD）（批號(hào)：00019435，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），兔多抗caspase-12（45 kD）（批號(hào)：gr143401-9，Abcam）；電子天平（精度0.01 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），水平搖床（TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京六一儀器廠），病理切片機(jī)（德國(guó)Leica RM 2016 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)），奧林巴斯BX53 型生物顯微鏡，載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.3 小鼠膿毒癥模型制備

建立膿毒癥小鼠模型[6]。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的水合氯醛350 mg/kg 麻醉，于左下腹作長(zhǎng)1～1.5 cm 切口，游離腸系膜和盲腸，在距盲腸盲端2/3 長(zhǎng)度處環(huán)行結(jié)扎，在距盲端1 cm 處貫通穿刺，擠出糞便少許，回納腸系膜和盲腸入腹腔。逐層縫合關(guān)腹，其中假CLP 組只進(jìn)行開腹關(guān)腹處理，術(shù)后不注射人參皂苷，正常組不做任何處理。模型制備成功后立即向小鼠人參皂苷組腹腔注射20 mg/kg 的人參皂苷Rb1 溶液，而CLP 組和假CLP 組則注射等體積的生理鹽水，之后每間隔8 h 追加腹腔注入。術(shù)后小鼠自由進(jìn)食飲水，24 h 后取材。

1.4 一般狀況和大體形態(tài)學(xué)

動(dòng)物造模術(shù)后24 h 內(nèi)觀察動(dòng)物有無(wú)萎靡、寒顫、豎毛、腹瀉、膿性尿及眼角分泌物增加，以及其呼吸、大小便、飲食和活動(dòng)情況。

1.5 病理學(xué)檢測(cè)

動(dòng)物造模術(shù)后24 h 處死動(dòng)物，將取得的小鼠心肌及肺組織浸入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察，分析各組病理改變。

1.6 蛋白測(cè)定

將每組取得的6 只小鼠的心肌及肺組織保存。Western blot 檢測(cè)GRP78、caspase-12 蛋白表達(dá)：組織塊置于EP 管中勻漿及裂解，將裂解液移至離心管中，4℃下12 000 r/min 離心5 min（離心半徑7.5 cm），取上清液-20℃保存。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）適當(dāng)稀釋蛋白，避光孵育30 min 后電泳，轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的封閉液（TBST）浸泡PVDF 膜，搖床封閉2 h，再將PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF 膜。稀釋二抗，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，搖床孵育2 h。將ECL 試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1 比例混勻，滴加工作液于PVDF 膜上，熒光帶明顯后吸去多余底物液，覆上保鮮膜，X 光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗晾干，掃描膠片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及大體觀

與正常組比較，CLP 組小鼠活動(dòng)減少，嗜睡，精神明顯萎靡，食欲減退，體重減輕，膿尿。瀕死前寒顫、呼吸窘迫。解剖可見CLP 組小鼠腹腔混濁，膿性滲出液較多，伴惡臭；盲腸腫脹發(fā)黑、壞疽和粘連；心臟等重要臟器顏色暗紅，表面可見出血斑點(diǎn)。人參皂苷組小鼠上述改變均較CLP 組明顯減輕，解剖人參皂苷組小鼠腹腔未見明顯膿性滲出，無(wú)惡臭，盲腸輕度腫脹，無(wú)粘連，心臟等重要臟器顏色表面未見明顯出血斑點(diǎn)。與CLP 組比較，假CLP 組小鼠各方面情況與人參皂苷組大致相同或更輕。

2.2 病理學(xué)改變

肺組織：CLP 組可見肺間質(zhì)及肺泡毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，充血水腫，肺泡間隔增寬，部分區(qū)域肺萎縮，肺泡腔大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；人參皂苷組肺泡組織結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰、完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肺泡大小均勻；正常組及假CLP 組病理下組織清晰可見，未見明顯異常。

心肌組織：CLP 組心肌橫紋模糊，波浪樣變、細(xì)胞核壞死嗜酸性變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；人參皂苷組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，心肌橫紋可見，壞死細(xì)胞少；假CLP 組和正常組心肌纖維均排列整齊，未見異常。見圖1。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子蛋白表達(dá)

圖1 4 組小鼠肺組織、心肌組織病理下改變（HE 染色，200×）

與假CLP 組比較，CLP 組心肌及肺組織GRP78、caspase-12 蛋白表達(dá)水平在術(shù)后均顯著上調(diào)，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與CLP 組比較，人參皂苷組心肌及肺組織GRP78、caspase-12 蛋白表達(dá)水平均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與假CLP 組比較，人參皂苷組蛋白表達(dá)水平略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表1。

圖2 人參皂苷Rb1 對(duì)心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、caspase-12 蛋白表達(dá)

表1 心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的測(cè)定（）

表1 心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的測(cè)定（）

注：與假CLP 組比較，*P＜0.01；與CLP 組比較，#P＜0.05。GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予人參皂苷Rb1 能夠減輕膿毒癥小鼠心肌和肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78 及caspase-12 蛋白表達(dá)，減輕膿毒癥小鼠的感染程度及重要器官損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡。持久或者強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)引發(fā)程序性細(xì)胞死亡或凋亡[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是膿毒癥的重要病理機(jī)制，有助于成為病情診斷及治療的合適靶點(diǎn)[8]。Ferlito 等[9]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膿毒癥發(fā)病過程起主要的負(fù)面作用，并提出臨床干預(yù)的新靶標(biāo)以及治療的潛在策略。GRP78 是啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一[10-11]。下調(diào)GRP78 能夠明顯減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激，改善膿毒癥細(xì)胞損傷[12]。caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上特有的一種caspase 蛋白，只在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡中出現(xiàn)，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的小鼠凋亡途徑中發(fā)揮核心作用[13]。本研究觀察到，CLP 組小鼠心肌及肺組織中檢測(cè)到的GRP78 和caspase-12 蛋白濃度均能較假CLP 組及正常組明顯升高。

膿毒癥被定義為感染伴器官功能障礙，尋找改善和治療膿毒癥的藥物仍是當(dāng)前的任務(wù)所在[14]。中醫(yī)認(rèn)為，膿毒癥屬于外感病癥中危重癥候，“瘀血、熱毒”是膿毒癥的主要發(fā)病機(jī)制，治療以“清熱涼血，解毒，活血行瘀通絡(luò)”為原則，在西醫(yī)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用中藥治療可有效抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，抑制膿毒癥患者過度免疫應(yīng)答[15]。人參皂苷是人參的主要成分，其藥用價(jià)值已得到廣泛肯定，已應(yīng)用于多種疾病的治療和預(yù)防[16-17]。人參皂苷Rb1 作為人參提取得到的一種活性物質(zhì)，具有多種藥理活性，提取及分離也相對(duì)簡(jiǎn)單，是目前的研究熱點(diǎn)[18]。

研究指出，人參皂苷可以減輕炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，增加一氧化氮合成，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[19]。曹暢等[20]指出人參皂苷Rb1 可以通過抗氧化、抗凋亡、抑制鈣超載等機(jī)制在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，能減少炎性因子的釋放，抑制白細(xì)胞趨化及黏附，降低血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)血管新生等。馮其麟等[21]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給重癥感染小鼠盡早注射人參皂苷Rb1 可以降低小鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)水平，其機(jī)制可能是通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常蛋白表達(dá)，緩解細(xì)胞凋亡啟動(dòng)進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)。臧安緣等[22]在構(gòu)建大鼠心肌缺血模型實(shí)驗(yàn)中證實(shí)人參皂苷Rb1 可改善心肌缺血大鼠細(xì)胞損傷，通過減少線粒體釋放凋亡因子，清除氧自由基，抑制心肌細(xì)胞的凋亡及自噬通路的傳導(dǎo)，從而抗心肌缺血保護(hù)心肌。Zhao 等[23]在發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1作為人參的生物活性成分，能夠誘導(dǎo)下調(diào)Bax/Bcl-2比值和caspase-3表達(dá)水平來預(yù)防大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

4 小結(jié)

總之，人參皂苷Rb1 因其相對(duì)簡(jiǎn)單的提取過程，并且在人參、三七、西洋參等植物中占有較大比例等優(yōu)勢(shì)，近年來越來越受到重視。人參皂苷Rb1 能夠?qū)δ摱景Y小鼠起到一定的保護(hù)作用，可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度表達(dá)而發(fā)揮作用，但膿毒癥發(fā)病復(fù)雜，機(jī)制尚未完全闡明，并且人參皂苷Rb1 是否存在其他途徑減輕炎性反應(yīng)還有待證實(shí)，關(guān)于人參皂苷Rb1 對(duì)膿毒癥的具體保護(hù)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。