陳遠群 諶 平 陳國創(chuàng) 韋枝紅

1.深圳大學第一附屬醫(yī)院深圳市第二人醫(yī)院婦科，廣東深圳 518035；2.中國科學院深圳先進技術研究院，廣東深圳 518055；3.廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院（原深圳大學第一附屬醫(yī)院深圳市第二人醫(yī)院）婦科，廣東深圳 518101

卵巢癌是婦科惡性腫瘤死亡率最高的一種[1-2]，其高死亡率除了因早期發(fā)現(xiàn)困難，更重要是其晚期化療效果不佳[3-4]。大多數(shù)卵巢癌細胞在經(jīng)歷鉑類等細胞毒性藥物治療后，均出現(xiàn)優(yōu)勢克隆適應性進化[5-7]，耐藥性的出現(xiàn)。因此，我們急需建立一種有效、安全的卵巢癌晚期治療方案，單克隆抗體療法中的雙特異性T 細胞銜接器（BiTE）的獨特功能為婦科腫瘤免疫治療中明星分子[8-10]。本實驗主要選擇靶向上皮細胞黏附分子（EpCAM），作為卵巢癌細胞特異的上皮黏附因子及T 細胞特異黏附因子CD3，作為BiTE 的兩個特異抗體。采用非病毒載體微環(huán)DNA 表達系統(tǒng)獲取蛋白。觀察抗EpCAM 加抗CD3 雙特異BiTE 分子蛋白（抗EpCAM/抗CD3 BsAb）對誘導T 細胞特意殺傷卵巢癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-red，美國）；倒置生物顯微鏡（OLYMPUS，日本）；Bright-GloTM螢光素酶檢測系統(tǒng)（Promega，E2610）；分選型流失細胞儀（BD Cano Ⅱ）；動態(tài)光散射粒徑測試儀（Malvern，英國）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）；Anti-6*His tag antibody（Abcam，美國）；蛋 白顯影液（Cell Signaling，美國）；PVDF 膜（Millipore，美國），anti-rabbit IgG（Cell Signaling，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 的制備 采用X-treme-GENE HP DNA transfection reagent 和表達載體SZ-90 EpCAMxCD3 瞬時轉染HEK293 細胞，使用Expi293表達培養(yǎng)基獲得大量含有表達產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)上清。收集上清液進行蛋白的檢測。

1.2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 的純化 用cOmplete His-Tag Resin 和?KTA 蛋白純化系統(tǒng)分離純化BsAb抗體。采用Werstern blot 技術。將抗EpCAM/抗CD3 BsAb 表達上清液和HEK293 細胞裂解液，加入5×蛋白loading buffer 混合。轉膜，切取蛋白Marker 在14～97 kD 的位置，將其覆蓋在PVDF 膜的負極方向，將混合液滴加到膜上并進行曝光成像。

1.2.3 流式細胞術檢測BiTE 對T 細胞和EpCAM+腫瘤細胞的選擇性結合，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向性檢測 抗體分別和（A）T 細胞、（B）CaOV3-luc 細胞孵育，后加入APC-conjugated anti-His 抗體作為二抗，流式細胞術檢測熒光強度。

1.2.4 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導T 細胞對人卵巢癌CaOV3 的細胞毒性作用 本實驗分4 組進行觀察：T 細胞組、卵巢癌細胞組、T 細胞加卵巢癌細胞組以及抗體加T 細胞加卵巢癌細胞組。T 細胞、SKOV3細胞和抗體孵育。分別用碘化丙啶（PI）和Calcein-AM復染，將PI+Calcein-AM 培養(yǎng)，分別在光鏡以及倒置熒光顯光顯微鏡觀察，并采用電腦合成圖像把PI 和Calcein-AM 染色圖像融合于一圖中觀察。

1.2.5 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導T 細胞殺傷卵巢癌CaOV3 細胞 效靶比為10∶1，T 細胞、CaOV3-luc細胞和抗體共孵育6 h 和12 h，培養(yǎng)基：98McCoy 5a +1FBS+1 青/鏈霉素雙抗，ONE-GloTM螢光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒檢測抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導的T 細胞毒性作用。Promega GloMax 96 微孔板發(fā)光檢測儀設置：讀取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 體外表達

采用蛋白電泳分離細胞上清液中抗體，見抗體外表達成功，分子量約為59 kD，無其他雜帶出現(xiàn)。見圖1。

圖1 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 抗體表達

2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 體外表達提純

使用蛋白質免疫印跡技術順利提純抗體。見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測抗EpCAM/抗CD3 BsAb 可分別靶向結合T 細胞及卵巢癌細胞

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向結合T 細胞檢測結果 單一T 細胞的平均熒光強度（MFI）：1587?？贵w加T 細胞后的MFI：24 625。由圖可見未結合抗體的T細胞與結合抗體T 細胞在流式細胞儀下明顯區(qū)分，提示抗體能夠靶向結合T 細胞。見圖3。

圖2 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 抗體的Western blot 檢測

圖3 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 與T 細胞特異性結合

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向結合卵巢癌細胞檢測結果 單一卵巢癌細胞的MFI：1809。抗體加卵巢癌細胞后的MFI：84526。由圖可見未結合抗體的卵巢癌細胞與結合抗體卵巢癌細胞在流式細胞儀下明顯區(qū)分，提示抗體能夠靶向結合卵巢癌細胞。見圖4。

2.4 抗體介導T 細胞對人卵巢癌的細胞毒性作用的形態(tài)學變化

2.4.1 光鏡和Calcein-AM 染色圖 見T cells+CaOV3腫瘤細胞均散在分布，少許T 細胞圍繞腫瘤細胞。T cells +SKOV-3+抗體圖：T 細胞和腫瘤細胞聚集成塊的卵巢癌腫瘤-T 細胞團，散在T 細胞較少。見圖5。

2.4.2 PI 染色圖 卵巢癌細胞和T 細胞組：少量卵巢癌細胞及少量T 細胞被PI 染色，說明卵巢癌細胞和T 細胞中有少量死細胞。T cells+CaOV3 組見死亡細胞增多并聚集。T cells +SKOV-3+抗體組：T 細胞和卵巢癌細胞大量聚集，并成塊的卵巢癌腫瘤-T 細胞團，死亡細胞明顯增加。見圖5。

圖4 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 與卵巢癌細胞CaOV3-luc cells特異性結合

2.4.3 融合圖 增加抗體后的卵巢癌細胞死亡細胞數(shù)較明顯增多，并聚集成團。見圖5。

2.5 抗體對于誘導T 細胞殺傷卵巢癌細胞的細胞特異性殺傷率隨時間以及濃度的變化情況

抗體對于誘導T 細胞殺傷卵巢癌細胞的細胞特異性殺傷率隨時間的延長效果不是一直增強。抗體的濃度低于1×10-6μg/mL 時，6 h 的特異性殺傷率與12 h比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而濃度升高時，12 h 的效果較6 h 更強，隨著劑量的增加而殺傷效果更好，直到濃度到達1×10-3μg/mL，出現(xiàn)效果下降。抗體的濃度≥1×10-5μg/mL 時，兩個時間的特異殺傷率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩個不同時間的特異殺傷率均在1×10-4μg/mL 的濃度時，殺傷效率最強。見表1。

3 討論

卵巢癌是婦科死亡率第一[11]的惡性腫瘤。耐藥及殺傷自身健康細胞是造成其高死亡率的重要原因之一[12]。近年來，癌癥的免疫治療在血液系統(tǒng)等惡性腫瘤治療中取得卓越的成就[13-14]，免疫治療的巨大優(yōu)越性讓其在腫瘤化療治療中成為研究的熱點[15-16]。傳統(tǒng)的抗體基因療法中抗體半衰期短，技術要求高精阻礙免疫治療的推廣。本研究采用的非病毒載體的微環(huán)DNA 可以在同等條件下實現(xiàn)持續(xù)表達。微環(huán)DNA 能在體內(nèi)長期、穩(wěn)定、高效地表達目的基因且?guī)缀鯚o毒性。目前本實驗所使用的微環(huán)DNA 的制備技術在已實現(xiàn)安全、無毒、高質量的規(guī)?；苽鋄17]并取得中國專利201510859263.2。

圖5 Calcein-AM 和PI 雙染色觀察細胞凋亡情況（標尺：200μm）

表1 不同濃度BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 作用不同時間對卵巢癌細胞的特異殺傷率比較（n=4）

EpCAM 在卵巢癌細胞中高表達并可促進卵巢癌細胞生長，種植，轉移等[7]，本實驗BiTE 的兩種抗體[18]，一靶向腫瘤細胞EpCAM，另一靶向T 細胞表面分子CD3，橋接卵巢癌細胞和T 細胞，介導特異性殺傷。本實驗可清晰看到非病毒載體MC 系統(tǒng)成功表達抗Ep-CAM/抗CD3 BsAb。

研究表明腫瘤細胞的免疫殺傷主要是通過雙特異抗體在腫瘤細胞和T 細胞之前形成“免疫突觸”[19-20]，起到抗腫瘤的免疫反應。本實驗通過PI 和Calcein-AM 雙染色，倒置顯微鏡下見T 細胞+卵巢癌+抗體組中T 細胞向卵巢癌細胞的集結增加，并出現(xiàn)大量細胞死亡。側面上證明抗體能夠增強誘導T 細胞靶向殺傷卵巢癌細胞。

觀察升高濃度和延長時間下，抗體對于誘導T 細胞的特異殺傷率并不是無限增強。在同樣6 h 的作用下抗體濃度高于1×10-7μg/mL 后，隨著濃度的上升，特異殺傷率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但這樣的趨勢并不是無限的延伸；在濃度1×10-3μg/mL 后，才出現(xiàn)特異殺傷效果下降。在濃度達1×10-6μg/mL 之前，6 h 的特異殺傷率較高；濃度達1×10-6μg/mL 后12 h 的殺傷較6 h 的殺傷率高。濃度在1×10-4μg/mL時，兩時間均達到最大的殺傷。也可以理解，在使用抗體濃度方面需要，1×10-5μg/mL～1×10-4μg/mL 持續(xù)時間12 h 時，抗體誘導T 細胞殺傷卵巢癌細胞最強。由此推斷，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 誘導T 細胞特異性殺傷卵巢癌細胞具有一定的時間以及藥物濃度的依賴性，大劑量藥物濃度并不會提高其對卵巢癌細胞的殺傷性，而過于密集的使用亦不能提高其殺傷性，而是在一定的濃度以及時間時間間隔里使用方可提高此抗體誘導T 細胞特異殺傷卵巢癌。此實驗亦為未來動物以及人體實驗提供一個濃度以及時間節(jié)點。

綜上所述，本實驗進一步證明anti-EpCAM/CD3雙特異抗體具有介導T 細胞靶向、高效清除卵巢癌細胞；本實驗所使用的非病毒載體的方法，基于微環(huán)DNA 載體表達雙特異抗體的抗癌策略的具有可行性，為卵巢癌的免疫治療提供一種可選的基因藥物。本實驗同時提出，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 誘導T 細胞殺傷具有一定的時間以及劑量的依賴性，為未來臨床試驗提供一可行的時間以及劑量數(shù)據(jù)。