易 欣 劉 暢 周 易 蔣學(xué)俊

(1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，2 武漢大學(xué)心血管病研究所，3 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：yixin321624@126.com)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是在排除冠狀動(dòng)脈疾病所致缺血性心肌病或其他疾病導(dǎo)致心臟負(fù)荷異常的情況下，出現(xiàn)的以左、右心室擴(kuò)張和心臟舒張/收縮功能障礙為臨床特征的一類心肌病[1]。DCM是年輕患者發(fā)生心力衰竭的主要原因之一，也是心臟移植最常見的手術(shù)指征[2]。研究表明，心肌纖維化在DCM中起到重要作用，膠原蛋白在心肌組織中的過(guò)度增生和沉積是心肌纖維化的典型病理改變，尤以Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ，ColⅢ)為主[3]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1、TGF-β2、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是心肌纖維化、肺纖維化、肝纖維化和腎纖維化中的重要促纖維化因子[4-6]。本研究旨在探討TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白在DCM心肌組織中的表達(dá)情況及其與纖維化程度的相關(guān)性，進(jìn)一步深入研究以上因子評(píng)估DCM患者心肌纖維化程度的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集9例行心臟移植術(shù)的DCM患者的受體心臟組織作為DCM組。納入患者均符合2006年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)制定的DCM診斷標(biāo)準(zhǔn)，即左心室舒張末期內(nèi)徑>55 mm、左心室射血分?jǐn)?shù)<45%或左心室縮短速率<25%[7]。排除其他可以引起心臟擴(kuò)張的心血管疾病和全身性疾病如冠狀動(dòng)脈性心臟病、先天性心臟病、高血壓、自身免疫性疾病。同時(shí)收集因心源性因素所致移植失敗的供體心臟組織7例作為對(duì)照組。

1.2 DCM患者臨床資料的收集 收集DCM患者的超聲心動(dòng)圖結(jié)果，包括左心室內(nèi)徑、右心室內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)。

1.3 心肌組織相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本處理：切取DCM患者受體心臟及移植失敗供體心臟的左心室心肌組織，于冰上迅速去除心臟表面的結(jié)締組織，于生理鹽水沖洗，分為兩份：一份切成小組織塊，放入凍存管內(nèi)，液氮中迅速冷凍后-80℃保存，用于檢測(cè)TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA表達(dá)；另一份修剪后置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片，用于觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、評(píng)估心肌纖維化程度。

1.3.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色：石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫苯、水洗、蘇木素染色、0.1%鹽酸酒精分化、Scott液返藍(lán)、伊紅染色、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。最后在顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX53)下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列特點(diǎn)。

1.3.3 苦味酸-天狼星紅(picric-sirius red，PSR)染色：制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后，依次經(jīng)磷鉬酸染色、0.1%苦味酸-天狼星紅染色、0.01 mmol/L鹽酸分化、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。最后光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX53)下觀察心肌組織中紅色膠原纖維的分布情況，拍照并計(jì)算膠原容積百分比(collagen volume fraction，CVF)，CVF=膠原面積/圖像面積×100%。

1.3.4 TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表達(dá)水平。采用TRIzolTMReagent試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596026)提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)：RR036A)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再應(yīng)用LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒(德國(guó)Roche公司，批號(hào)：04707516001)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系嚴(yán)格參照說(shuō)明書配制，20 μL的反應(yīng)體系包括10.0 μL LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master(2×)、0.5 μL 10 μmol/L PCR上游引物、0.5 μL 10 μmol/L PCR下游引物、1.0 μL cDNA模板和8.0 μL RNase Free dH2O；反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 2 min、變性95℃ 10 s、退火58℃ 30 s、 延伸72℃ 30 s，一共40個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min延伸后，于4℃終止反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DCM患者的超聲心動(dòng)圖結(jié)果 超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果顯示DCM患者雙心室擴(kuò)大，右心室內(nèi)徑為(51.25±6.99)mm，左心室內(nèi)徑為(71.33±13.59)mm，左心室擴(kuò)張更為顯著；心肌室壁運(yùn)動(dòng)幅度普遍降低，左室射血分?jǐn)?shù)明顯下降，為(26.22±9.18)%。

2.2 兩組組織病理檢查結(jié)果 與對(duì)照組相比，HE染色可見DCM組心肌組織排列紊亂、心肌細(xì)胞不同程度肥大，胞漿內(nèi)少許空泡形成，核多形性增加，PSR染色可見DCM組心肌間質(zhì)中大量紅色膠原纖維沉積、彌漫性分布，見圖1。此外，DCM組的CVF為(43.35±4.32)%，高于對(duì)照組的(1.65±0.43)%(t=-25.228，P<0.001)。

圖1 對(duì)照組和DCM組心室肌組織的病理學(xué)改變(HE染色，×40；PSR染色，×20)

注：PSR染色中黃色為心肌組織，紅色為膠原纖維。

2.3 兩組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DCM組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、ColⅠ、ColⅢ的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

2.4 DCM患者心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA表達(dá)水平與CVF的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DCM患者心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表達(dá)水平與CVF均呈正相關(guān)(r=0.924，P=0.003；r=0.955，P=0.001；r=0.964,P<0.001；r=0.941，P=0.002；r=0.858，P=0.013)。

3 討 論

DCM是由遺傳、感染、中毒、自身免疫等因素引起的，以心室擴(kuò)張、室壁變薄、收縮功能降低為臨床特點(diǎn)的一類心肌病，容易并發(fā)心力衰竭、惡性心律失常、心源性猝死等[1，8]。心室重構(gòu)是DCM發(fā)生發(fā)展中最為重要的病理生理過(guò)程，而心肌纖維化是DCM心室重構(gòu)的典型病理特征。心肌纖維化的進(jìn)展與DCM的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，心肌纖維化的程度與DCM患者的預(yù)后密切相關(guān)[9-12]。因此，研究DCM心肌纖維化的臨床特征和發(fā)生機(jī)制，尋找抗心肌纖維化的靶點(diǎn)，對(duì)控制DCM患者病情進(jìn)展、改善臨床預(yù)后具有重要的臨床意義。

細(xì)胞外基質(zhì)異常增生堆積，以及心臟成纖維細(xì)胞異常增殖、表型轉(zhuǎn)化和遷移是心肌纖維化最主要的病理改變[13]。細(xì)胞外基質(zhì)主要由豐富的ColⅠ、ColⅢ及較少的ColⅣ、ColⅤ、ColⅥ構(gòu)成，他們?cè)诰S持心室形狀、心肌細(xì)胞排列以及心肌正常收縮功能中發(fā)揮重要作用[14]。生理情況下，各型膠原蛋白的合成與降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；心肌纖維化時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)膠原增生，各型膠原蛋白比例失調(diào)，以ColⅠ、ColⅢ的改變最為明顯[15]。此外，促纖維化細(xì)胞因子與抑纖維化細(xì)胞因子的失調(diào)也是心肌纖維化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[16-17]。促纖維化細(xì)胞因子活化、表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞異常增殖、表型轉(zhuǎn)化，合成大量膠原纖維，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌纖維化。其中，細(xì)胞因子TGF-β以及CTGF是各器官、組織纖維化進(jìn)展中的重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子[18-19]。TGF-β是一類分泌型的多肽細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其功能涉及多類細(xì)胞的增殖、分化、凋亡調(diào)節(jié)等[20]。家族成員TGF-β1主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞[21]，可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖分化，抑制膠原降解，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積；并可抑制金屬蛋白酶生成，增加細(xì)胞間黏附，保持肌纖維母細(xì)胞生存能力[22]。TGF-β1/Smad 3的激活在心肌纖維化中起重要作用，可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞異常增殖及ColⅠ的過(guò)表達(dá)[23]。家族成員TGF-β2主要表達(dá)在上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞[21]。Bao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可上調(diào)CTGF，致人房水Tenon′s囊成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)青光眼濾泡瘢痕形成。Ma等[25]發(fā)現(xiàn)TGF-β2可誘導(dǎo)CTGF表達(dá)上調(diào)，致人晶狀體上皮細(xì)胞增殖，加速白內(nèi)障進(jìn)程。目前有關(guān)TGF-β2的研究主要集中在眼科學(xué)，其在心肌纖維化中作用的研究相對(duì)較少。CTGF也是一種分泌型的多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，參與血管生成、組織修復(fù)、組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，是組織器官纖維化的重要標(biāo)志物之一[26]。研究表明CTGF是TGF-β1的下游調(diào)控因子[19]。正常狀態(tài)下，心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞分泌CTGF到心肌間質(zhì)中，維持一定的基礎(chǔ)分泌量；心肌纖維化時(shí)，TGF-β1可異常上調(diào)CTGF的表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)膠原蛋白的合成[27]。

目前，臨床主要以心臟超聲檢查結(jié)果作為DCM的診斷依據(jù)，常以心臟擴(kuò)大程度來(lái)評(píng)估病情進(jìn)展和判斷預(yù)后。然而，心臟超聲檢查的準(zhǔn)確性有賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)及熟練程度，若單純以心臟超聲結(jié)果作為DCM患者病情評(píng)估的依據(jù)，其可靠性還需斟酌。DCM患者心肌組織中有大量膠原蛋白沉積，因此，目前認(rèn)為可采用對(duì)膠原檢測(cè)敏感的心臟磁共振T1映射成像與細(xì)胞外容積來(lái)評(píng)估心肌纖維化程度，對(duì)DCM患者的疾病進(jìn)展和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，但目前在臨床上尚未開展[28]。本研究結(jié)果顯示，DCM患者心室肌組織中紅色膠原纖維沉積明顯，CVF增加(P<0.05)，提示DCM患者心肌纖維化嚴(yán)重；同時(shí)TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)的mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)，且均與CVF水平呈正相關(guān)，這提示TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)均在DCM患者心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。因此，若對(duì)DCM患者行心肌組織活檢，測(cè)定心肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的表達(dá)，可對(duì)患者的疾病發(fā)展及預(yù)后做出更為準(zhǔn)確的判斷。但在實(shí)際臨床工作中，愿意接受心肌組織活檢的患者數(shù)量比較少，檢測(cè)以上細(xì)胞因子在心肌組織中表達(dá)的技術(shù)很難廣泛開展。而TGF-β1、TGF-β2、CTGF作為分泌型細(xì)胞因子，其血清表達(dá)水平也可一定程度上反映DCM患者心肌纖維化程度，在臨床實(shí)際中對(duì)評(píng)估DCM患者疾病轉(zhuǎn)歸具有一定的實(shí)際意義。此外，TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白也可作為抗心肌纖維化藥物研究的重要靶點(diǎn)，有助于抗心肌纖維化藥物的進(jìn)一步研發(fā)，為控制甚至逆轉(zhuǎn)DCM患者心室重構(gòu)提供參考依據(jù)。