許祥 董維鵬 張少華 馮晨毅 劉田福 燕炯

（1.山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學動物實驗中心，太原 030001）

CRISPR/Cas9技術是近年來新出現(xiàn)的一種基因修飾技術，得益于其操作簡單、高效率和低成本的優(yōu)勢在基因編輯領域被廣泛應用［1-2］。通過改良的CRISPR技術，已經可以實現(xiàn)基因敲除、基因沉默、基因敲入以及各種目的的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)元件sgRNA和Cas9蛋白，可以通過不同載體作用于目的基因，無論是質粒、慢病毒或者直接轉染sgRNA與Cas9蛋白的混合物，都可以很方便的實現(xiàn)基因編輯［3］。由于sgRNA的切割活性受到眾多因素影響［4-6］，且CRISPR/Cas9系統(tǒng)允許錯配的出現(xiàn)，所以獲取高效的sgRNA并驗證其切割活性是實現(xiàn)靶向編輯的關鍵。

脂滴結構蛋白Perilipin蛋白高表達于白色脂肪組織中［7-8］，主要功能是保護脂滴中的脂質免受脂肪酶的作用，幫助脂質在脂滴中聚集［9］。圍脂滴蛋白（Perilipin1，PLIN1）是一種存在于脂滴表面可被磷酸化的蛋白，其表達量和肥胖成顯著正相關，并且在高血壓等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，在基礎狀態(tài)下，PLIN1對脂滴發(fā)揮屏障作用，可以有效降低甘油三酯的分解，當其含量降低或者發(fā)生磷酸化時，就可以加快甘油三酯的分解，且其基因的表達受到PPARγ的調控，是脂質代謝的一個重要環(huán)節(jié)，但其具體調節(jié)機制尚不清楚。本課題基于CRISPR/Cas9技術，設計了3條理論切割效率最高的sgRNA序列，并對其進行體外切割活性驗證和細胞轉染基因敲除效率驗證。得到了可以高效率切割PLIN1基因的sgRNA序列，并初步探究了PLIN1對脂解的影響，旨為后續(xù)PLIN1基因敲除動物模型的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪細胞系、FBS（胎牛血清）、DMEN/F12細胞培養(yǎng)基、Western blot相關試劑（武漢BOSTER生物工程公司），大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、瓊脂糖、DNA Marker、細胞基因組DNA提取試劑盒、PCR 實驗相關試劑（北京天根生化科技有限公司），限制性內切酶、T4 PNK、Quick Ligase（美國NEB公司），sgRNA 體外轉錄試劑盒、Cas9 體外酶切試劑盒（蘇州泓迅生物科技股份有限公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司），CRISPR 基因敲除表達載體（PX459）（美國Addgene公司），氨芐青霉素（合肥博美生物科技有限公司），蛋白Maker（北京聚合美生物科技有限公司），Perilipin 1抗體（英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA的設計與合成 根據NCBI中公布的小鼠PLIN1基因序列，應用在線工具（http：//crispr.mit.edu）設計可以識別PLIN1基因2號外顯子的gRNA序列。根據脫靶位點、基因數(shù)和發(fā)生錯配的可能性大小進行分析，給出所有序列。選擇3條特異性較好的gRNA序列（表1）作為實驗序列。

表1 guideRNA序列

將 T7（TAATACGACTCACTATAGGG） 啟 動子添加到設計好的gRNA序列的5'端，保守序列（GTTTTAGAGCTAGAAATAG）添加到3'端作為體外轉錄上游引物，由上海生工公司合成。

1.2.2 Cas9/gRNA表達載體的構建及鑒定 選擇CRISPR基因敲除質粒PX459（圖1）作為載體，在gRNA scafflod位置加入目的sgRNA序列。氨芐青霉素抗性基因用于質粒轉化與擴增過程的篩選，嘌呤霉素抗性基因用于轉染過程的篩選。在3對PLIN1gRNA的5'端添加黏性末端后，將得到的PLIN1 sgRNA上下游引物配置成100 mmol/L，各取1mL，加入10×T4 ligation Buffer 1 mL，T4 PNK 0.5 mL，定容到10 mL。37℃孵育30 min進行激酶處理，95℃孵育5 min，緩慢降溫至25℃。用限制性內切酶BbsI在PX459質粒2個BBS酶切位點（第 245、267位置）切割質粒，使其線性化。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收線性化質粒載體。將sgRNA退火產物與回收的線性化載體用T4連接酶進行連接，連接體系于16℃過夜。構建好的質粒載體轉化至DH5a菌群中，2 d后挑取單克隆送至北京微旋基因有限公司進行檢測。構建好的3個質粒載體分別命名為sgRNAPLIN1-1、sgRNA-PLIN1-2、sgRNA-PLIN1-3，并以未構建的PX459質粒作為陰性對照載體。

1.2.3 sgRNA序列的體外切割活性驗證

1.2.3.1 PCR體外擴增轉錄模板 利用3條PLIN1gRNA特異性體外轉錄上游模板和gRNA通用下游引物SG-R Primer，將人工合成的通用gRNA模板的DNA片段作為模板，通過PCR特異性擴增PLIN1的體外轉錄模板。擴增產物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用DNA純化試劑盒進行純化。

1.2.3.2 sgRNA體外轉錄 將擴增好的DNA轉錄模板按表2順序依次加入，充分混勻，37℃孵育4 h（可適當延長孵育時間）。轉錄完成后取少量反應液稀釋20倍，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的大小及完整性。使用RNA純化試劑盒進行純化，通過微孔板分光光度計測定轉錄產物的的濃度和純度。

1.2.3.3 Cas9體外酶切 構建Cas體外酶切體系，將得到的sgRNA與Cas9蛋白以及PLIN1基因片段（PLIN1-F：5'-GCAGAGGTAGACAGCCCAAG-3'；PLIN1-R ：5'-TCCTGCCACTGGTCCTACTC-3'） 混合孵育。設立陰性對照組（未加sgRNA），sgRNAPLIN1-1實驗組，sgRNA- PLIN1-2實驗組，sgRNAPLIN1-3實驗組，37℃孵育30-120 min。孵育完成后使用DNA純化試劑盒進行純化。純化結果進行瓊脂糖凝膠電泳觀察切割效率。

圖1 CRISPR/Cas9質粒表達載體

1.2.4 CRISPR/Cas9質粒載體細胞內活性鑒定

1.2.4.1 T3-L1細胞的培養(yǎng) 用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞：放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，2 d更換培養(yǎng)液1次。傳代時用胰酶消化細胞，并轉移細胞至10 mL無菌離心管中，800 r/min離心5 min。將細胞沉淀平均分到兩個新的含有5 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

表2 體外轉錄體系

1.2.4.2 電轉染 在電轉染前一天，細胞傳代，使細胞在轉染前融合度達到 80%。收集細胞沉淀至 EP管中。加入 500 mL 1640 培養(yǎng)基，充分吹打均勻。取10 mL細胞懸浮液，顯微鏡下觀察并計數(shù)。調整細胞濃度至 7×106/mL 左右，加入7 mg/mL 的質粒，吹打均勻。在0.2 mm電轉杯中加入含有質粒的細胞懸液 100 mL，按照預定條件設置參數(shù)（波型：指數(shù)波，電壓：160 V，電阻：500F），進行電穿孔。將電轉杯放入細胞恒溫培養(yǎng)箱中10 min，使質粒充分進入細胞。取出電擊杯，在預熱的細胞培養(yǎng)基（不含雙抗）中接種細胞懸液，搖晃均勻，放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4.3 嘌呤霉素篩選 細胞電轉染24 h后，用已確定的嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。2 d更換嘌呤霉素培養(yǎng)基一次，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，隨時觀察細胞生長狀態(tài)。轉移少量篩選后的細胞到一個新的細胞培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.2.4.4 誘導分化 將細胞接種于6孔板中，待細胞匯合至80%左右時，按本課題組前期優(yōu)化過的經典“雞尾酒”方法，誘導分化3T3-L1前脂肪細胞成為成熟的脂肪細胞［8］。首先用誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)細胞2 d，再用誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，每2 d換液1次。

1.2.4.5 實時熒光定量PCR檢測細胞中PLIN1 mRNA的表達 當細胞回合至80%左右的時候，PBS沖洗，收集到EP管中。按照試劑說明書的要求，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增，以β-actin為內參，用2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量。PLIN1基因cDNA RT-PCR引物，上游：5'-GAGAGGAGACAGACGACGAGGAG-3'，下游：5'-GGTCACTGCG GAGATGGTGTTC-3'，交上海生工公司合成。

1.2.4.6 Western blot檢測細胞中PLIN1蛋白的表達量 收集各組細胞沉淀至EP管中，加入200 μL細胞總蛋白裂解液，冰上裂解10 min，4℃、12000 r/min離心15 min，上層液體即為待測總蛋白樣品。采用BCA法測定各組待測樣品的總蛋白濃度并調平。PAGE電泳，電泳參數(shù)：濃縮膠80 V恒壓，分離膠120 V恒壓；濕式轉膜，參數(shù)：220 mA恒定電流，轉膜持續(xù)2 h。取出NC膜，浸入封閉液中封閉2 h。蛋白一抗4℃過夜孵育。次日取出條帶，孵育二抗，37℃搖床2 h。顯影儀曝光目的條帶，挑選目的條帶清晰、背景淺的圖片。用ImageJ軟件對目的蛋白條帶進行分析并測定吸光度值，以β-actin進行校正。

1.2.5 PLIN1基因敲除對3T3-L1細胞脂解的影響 細胞干預完成后，收集6孔板中的細胞至EP管。每個EP管中加入900 μL PBS緩沖液，用槍頭吹打細胞沉淀至細胞懸浮。在冰水浴條件下進行超聲破碎細胞。制備好的勻漿液直接按照甘油三酯（TG）試劑盒檢測說明書測定TG含量，每組以細胞總蛋白濃度對測定值進行校正。制備好的勻漿液70℃金屬浴10 min，滅活脂肪水解酶，嚴格按照甘油測定試劑盒說明測定樣本甘油含量。根據預先繪制的標準曲線計算各樣本的甘油含量，并以每mg蛋白濃度對測定值進行校正。

2 結果

2.1 CRISPR/Cas9質粒干擾載體構建及鑒定

構建的CRISPR/Cas9質粒載體進行靶位點測序，測序結果與預期目標一致（圖3），sgRNA序列成功連接到到質粒載體上，表明質粒載體構建成功。

2.2 sgRNA體外切割活性鑒定

通過PCR獲得帶有T7 Promoter的sgRNA體外轉錄模板，經瓊脂糖凝膠電泳檢測分子量在120 bp左右，與預期結果一致。對轉錄模板進行純化回收，濃度為44±3.1 ng/mL，A260/A280比值為1.89±0.04，證明體外轉錄模板構建成功。用sgRNA體外轉錄模板進行體外擴增，3條sgRNA轉錄體外轉錄產物均在100-200 bp之間（圖3），與預期結果一致。對轉錄產物進行純化回收，濃度全部大于5000 ng/mL，A260/A280比值為2.03±0.06，證明體外轉錄sgRNA成功。

圖2 CRISPR/Cas9質粒載體sgRNA測序結果

圖3 sgRNA體外轉錄產物電泳

以擴增好的PLIN1基因為底物，分別用3條sgRNA進行構建體外酶切體系，反應1 h后，底物被切割為2個條帶（圖4）。利用灰度值計算切割強度，得sgRNA-PLIN1-1的切割效率為61.8%±9.0%，sgRNA-PLIN1-2的 切 割 效 率 為64.1%±9.6%，sgRNA-PLIN1-3的切割效率為34.1%±7.2%。計算公式為，其中 fcut=切開的條帶強度之和/全部條帶強度之和。3組sgRNA均可成功切開底物PLIN1基因，其中sgRNA-PLIN1-3組的切割效率明顯低于sgRNAPLIN1-1組和sgRNA-PLIN1-2組，差異有統(tǒng)計學意義（圖5）。

2.3 3T3-L1前脂肪的誘導分化

顯微鏡下觀察，3T3-L1前脂肪細胞呈梭形，內部無明顯脂滴，誘導分化可以使細胞趨向圓形，并逐漸出現(xiàn)脂滴，油紅O染色后脂滴呈現(xiàn)“戒環(huán)樣”（圖6）。電轉染構建好的sgRNA-PLIN1-1、sgRNAPLIN1-2、sgRNA-PLIN1-3質粒載體和陰性對照質粒，12 h后貼壁，存活率均為80%左右，無顯著差異。嘌呤霉素殺死曲線確定嘌呤霉素 4 d 殺死細胞的最低濃度是 4 mg/mL；嘌呤霉素篩選細胞后，存活率均為30%左右，無顯著差異。

圖4 體外酶切瓊脂糖凝膠電泳

圖5 體外切割效率比較

2.4 3T3-L1脂肪細胞中PLIN1 mRNA的表達

在誘導分化的第4天，檢測sgRNA-PLIN1-1組、sgRNA-PLIN1-2組、sgRNA-PLIN1-3組、陰性對照組的PLIN1的mRNA表達量。如圖7所示，各陽性組中PLIN1mRNA表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。sgRNA-PLIN1-1組和sgRNA-PLIN1-2組的mRNA表達量較sgRNA-PLIN1-3組降低，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 3T3-L1脂肪細胞中PLIN1蛋白的表達

在誘導分化的第4天，檢測sgRNA-PLIN1-1組、sgRNA-PLIN1-2組、sgRNA-PLIN1-3組、陰性對照組和空白對照組的PLIN1的蛋白表達量。如圖7所 示，sgRNA-PLIN1-1組、sgRNA-PLIN1-2組 和sgRNA-PLIN1-3組的PLIN1蛋白幾乎不表達，差異無統(tǒng)計學意義。3組sgRNA陽性組與陰性對照組相比蛋白表達均有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。3組sgRNA陽性組與空白對照組相比蛋白表達均有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（圖8）。

圖6 3T3-L1細胞的誘導分化

圖7 PLIN1 mRNA相對表達量

2.6 PLIN1基因敲除對脂解的影響

各組細胞誘導分化第8 天油紅O染色，隨機選擇50個細胞，用Image pro plus軟件測量各個細胞中脂滴直徑大小。與對照組相比，陽性敲除組中小脂滴數(shù)量增加，中脂滴、大脂滴數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義（圖9）。測定各組細胞中的甘油三酯以及甘油含量，結果（表3）顯示與對照組相比PLIN1基因敲除組中甘油三酯含量較低，甘油含量較高，差異有統(tǒng)計學意義。

圖8 PLIN1蛋白表達相對量

圖9 脂肪細胞中脂滴大小數(shù)量

表3 脂肪細胞中TG與甘油含量

3 討論

脂質代謝紊亂會引發(fā)一系列慢性疾病，如肥胖癥、2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等，嚴重影響了人們的生命健康，降低了人們的生活質量［11］。研究者普遍認為，脂滴作為能量的貯存器，是一個復雜的、活動旺盛的、動態(tài)變化的多功能細胞器，脂滴內含有甘油三酯酶，它與其他細胞器（線粒體）相互作用，在脂質代謝與儲存、膜轉運等過程中發(fā)揮作用［12］。圍脂滴蛋白（Perilipin1，PLIN1）是脂滴表面蛋白的重要一員，完全定位在脂滴表面，在脂肪生成與脂滴成長過程中發(fā)揮重要作用［13］。本實驗可以明顯觀察到PLIN1基因的敲除會抑制小脂滴的聚集，促進甘油三酯的水解。

研究表明切割越靠前的外顯子導致移碼突變的概率越大，本次實驗前部針對PLIN1基因的2號外顯子設計sgRNA序列。體外活性切割實驗相較于細胞實驗具有高效、快速、低成本的優(yōu)勢。在實驗中，3條sgRNA序列皆可以靶向切割PLIN1基因的2號外顯子，但sgRNA-PLIN1-3組的效率明顯低于另外兩組。且通過觀察3條sgRNA切割位置發(fā)現(xiàn)，它們在目的基因上相距較近，且PAM序列都有較強的引導性，但切割效率卻有差異，說明影響其活性的因素很多。所以設計多條sgRNA并驗證其體外切割活性是有意義的。為進一步驗證體外活性的準確性，將3條sgRNA通過電轉染轉入3T3-L1前脂肪細胞中，驗證其在細胞內的切割活性。細胞內切割以后會引入雙鏈斷裂，發(fā)生同源重組。通過嘌呤霉素篩選轉染成功的細胞，3條sgRNA陽性組的PLIN1 mRNA和蛋白表達量均有顯著降低。RT-PCR實驗結果顯示，gRNA-PLIN1-1組和sgRNA-PLIN1-2組相較與sgRNA-PLIN1-3組有更高的活性。這證明體外切割活性好的sgRNA序列在細胞內仍保持較高的活性。兩組實驗可以相互預測，這與吳曦等［14］的實驗結論一致。mRNA水平的差異并未導致蛋白表達水平有明顯差異，但是可以明顯觀察到蛋白表達量水平的降低，可能原因是sgRNA的靶點基因組，mRNA水平的檢測敏感度高于蛋白水平。

4 結論

本研究證明了PLIN1基因可以促進脂解，設計了3條PLIN1基因的sgRNA，并構建其基因敲除載體。通過體內和體外活性實驗，證明了體外切割活性和體內切割活性有一致性，驗證了3條sgRNA的切割活性，得到了2條切割效率更高的sgRNA，為后續(xù)的基因敲除動物模型的構建奠定了基礎。