董哲,閆曉娟,杜會枝

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006)

0 引 言

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種以學(xué)習(xí)、認知和記憶障礙等為特征的神經(jīng)退行性疾病。AD的膽堿能缺失學(xué)說認為:乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)的合成、釋放及攝取減少或降解過多,造成ACh水平降低,進而導(dǎo)致AD病人學(xué)習(xí)能力下降和記憶力衰退[1]。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中水解ACh的一個主要功能酶,解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn),AD患者腦部的AChE蛋白表達水平升高[2-3]。近年來乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究越來越多[4],目前美國食品藥品管理局(FDA)批準上市的治療AD的藥物主要是AChE抑制劑,包括多奈哌齊、利凡斯的明和他克林等[5],但它們也有很明顯的副作用和毒性,且生物利用率低。因此,尋找新型、效率高且低毒的AChE抑制劑是研究熱點之一。

天然中草藥多種多樣,資源豐富,治療疾病時表現(xiàn)出毒副作用小,所以,得到越來越多研究人員的關(guān)注[6-7]。連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl),木犀科連翹屬植物,其果實是一種傳統(tǒng)中草藥,也是山西道地中藥材之一[8]。據(jù)藥典記載,連翹有清熱解毒和消腫散結(jié)等功效[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,連翹具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理功效[10]。夏秋交際之時,果實剛熟還帶有綠色時采摘,除去雜質(zhì),將其蒸熟,晾干得到的果實即為青翹(GreenForsythiasuspensa)。目前已經(jīng)從動物實驗研究發(fā)現(xiàn)連翹主要成分之一——連翹酯苷A對AD動物模型的學(xué)習(xí)記憶有改善作用[11-16],但尚未闡明連翹及其主要成分是否可以影響膽堿能系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)。本文采用Ellman法[17-18]對青翹中的AChE抑酶活性成分進行了篩選,并用敲除法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑藥品

青翹,2016年7月份采摘于山西省長治市屯留縣,經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定為木犀科連翹屬連翹果實,樣本編號為 20160702,自然陰干,用粉碎機磨成細粉,過60目篩,室溫下密封避光保存。

AChE(E.C. 3.1.1.7,來源于電鰻魚,編號:A832424,200 U/g)購于麥克林;碘化硫代乙酰膽堿(S-Acetylthiocholine iodide,Asch,編號:A602737)和5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB,編號:A620113)購于生工(上海);連翹酯苷A(編號:A0590)、蘆丁(編號:A0103H)、連翹脂素(編號:A1144)和連翹苷(編號:A0272)購于成都曼思特(純度均大于98%);色譜醋酸(編號:A35-500)和色譜甲醇(編號:A456-212)購于Fisher Scientific(上海);無水甲醇(編號:2334)購于天津市大茂化學(xué)試劑廠;D101大孔樹脂購于天津制膠廠。其他試劑藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 青翹的提取與分離

青翹粉末200 g,70%甲醇(V/V)為溶劑,以料液比1∶10,回流提取2次,每次2 h。用紗布粗濾,合并2次濾液。真空抽濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮,得到青翹粗提物。

1.3 不同乙醇濃度洗脫物制備

將青翹粗提物按照水,20%、40%、60%、80%和95%乙醇(V/V)的順序過D101大孔樹脂,梯度洗脫,將不同梯度洗脫物分別合并濃縮,冷凍干燥,得固體粉末,依次標記為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6。

1.4 AChE酶活測定

不同乙醇濃度洗脫物溶于DMSO中,配制樣品液。

在96孔板中利用Ellman方法[14-15]測定AChE酶活。一個EP管中依次加入275 μL PBS(pH=8.0),5 μL酶液(終濃度0.07 U/mL),10 μL樣品溶液和10 μL的DTNB(終濃度1 mmol/L),混合均勻。96孔板中每孔加入100 μL混合溶液,37 ℃ 孵育15 min后,加10 μL Asch(終濃度3 mmol/L),37 ℃ 繼續(xù)孵育25 min后,加入50 μL 4% SDS終止反應(yīng)。用MD Spectra Max 190酶標儀(美國)在412 nm下測吸光度值A(chǔ)。平行3次實驗,每次3個復(fù)孔。反應(yīng)體系中以不加酶作為空白組2,不加抑制劑作為空白組1。根據(jù)公式(1)計算酶活抑制率:

.

(1)

1.5 連翹酯苷A敲除實驗

Q2凍干粉末溶于DMSO中配制成80 mg/mL溶液,在Shimadzu LC-6AD液相儀(日本)進行連翹酯苷A敲除實驗。進樣量為400 μL。分析條件:Microsorb 100-5 C18 (21.4 mm×250 mm) 色譜柱,流速為0.8 mL/min,檢測波長為280 nm,以色譜甲醇為流動相A,以質(zhì)量分數(shù)0.3%醋酸水溶液為流動相B;梯度洗脫條件為:0～8 min,30%～33%(A),70%～67%(B);8～24 min,33%～40%(A),67%～60%(B);24～39 min,40%～48%(A),60%～52%(B);39～55 min,48%～64%(A),52%～36%(B)。22～26 min接出的樣品即為敲除的連翹酯苷A。合并22 min之前和26 min之后的樣品,即為敲除連翹酯苷A之后的剩余部分,我們定義為剩余物。將敲除的連翹酯苷A和剩余物部分分別冷凍干燥。

1.6 液相分析

將梯度洗脫物和剩余物樣品分別用色譜甲醇配制成1 mg/mL溶液,用Agilent 1260高效液相色譜儀(德國)進行液相分析。進樣量為10 μL。分析條件除色譜柱為Agela Technologies Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)外,其他條件與‘1.5連翹酯苷A敲除實驗’相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同乙醇濃度洗脫物對AChE酶活的抑制作用

不同乙醇濃度洗脫物對AChE酶活的抑制情況如表1所示,隨洗脫物濃度的增大(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL),Q2、Q3和Q4對AChE的抑制作用均逐漸增強,其中Q2對AChE的抑制作用(IC50值為(0.44 ± 0.002)mg/mL)強于Q3和Q4對AChE的抑制作用,IC50值分別為(0.68 ± 0.002)和(1.12 ± 0.002) mg/mL;而Q1,Q5和Q6對AChE沒有抑制作用,數(shù)據(jù)未顯示。

表1 Q2,Q3和Q4對AChE的抑制作用(%),數(shù)據(jù)表示為means ± SEM (n=5)

由液相圖(圖1)可以看出,Q2主要成分為:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A和蘆丁。Q3主要包括:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷。Q4主要成分為:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A和連翹苷。根據(jù)圖1得到的主要成分含量如表2所示:連翹酯苷A峰面積占比在Q2中是68.91%,Q3中為67.39%,Q4中是16.46%;而Q1,Q5和Q6中幾乎沒有連翹酯苷A。Q2和Q3中均含有連翹酯苷A,且含量相差無幾,但Q2 比Q3有較強的AChE抑制活性。推測出現(xiàn)這種情況的原因可能為Q2中連翹酯苷A,蘆丁和提取液中一些其他成分(連翹酯苷I、連翹酯苷B等)協(xié)同作用于AChE,增強了對AChE活性的抑制作用,根據(jù)上面實驗結(jié)果,我們得到20%乙醇洗脫物對AChE的抑制效果較好,推測連翹酯苷A可能是其中的一種有效作用成分。

Q1, Q2, Q2, Q3, Q4, Q5 and Q6 represent water wash, 20%, 40%, 60%, 80% and 95% ethanol,respectively.A: Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside;D:Forsythiaside; E: Rutin; F: Phillyrin; G: Phillygenin.Fig.1 Liquid phase diagram of different extractsQ1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6分別代表0%,20%,40%,60%,80%和95%乙醇。A:連翹酯苷I;B:連翹酯苷B;C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷;D:連翹酯苷A;E:蘆丁;F:連翹苷;G:連翹脂素。圖1 不同乙醇濃度洗脫物的液相分析圖

連翹酯苷I連翹酯苷B(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷連翹酯苷A蘆丁連翹苷連翹脂素 Q2峰面積767.27170.6482.442 918.9542.21--百分比/%18.114.031.9568.911.00-- Q3峰面積494.90132.09338.492 925.9576.71235.3165.99 百分比/%11.403.047.8067.391.775.421.52 Q4峰面積39.07-38.85204.60-779.5032.48 百分比/%3.14-3.1216.46-62.701.92

2.2 青翹主要成分對AChE酶活的抑制作用比較

圖2是連翹酯苷A和蘆丁對AChE酶活的抑制作用圖。由圖可知,隨連翹酯苷A濃度(5～400 μmol/L)和蘆丁濃度(20～650 μmol/L)的增大,連翹酯苷A和蘆丁對AChE的抑制作用均逐漸增強。其中連翹酯苷A對AChE酶活的抑制(IC50值為(45 ± 0.58)μmol/L)作用強于蘆丁對AChE酶活的抑制(IC50值為(242 ± 2.91)μmol/L)。連翹脂素和連翹苷對AChE酶活幾乎沒有抑制作用,數(shù)據(jù)未顯示。通過IC50比較,可以得出連翹酯苷A對AChE酶活的抑制作用最強。

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.2 Forsythiaside (A) or rutin (B) inhibited AChE activity數(shù)據(jù)表示為means ± SEM(n=3)圖2 連翹酯苷A(A)和蘆丁(B)對AChE的抑制作用

圖1中,Q3的主要成分比Q2多了連翹苷和連翹脂素,但連翹苷和連翹脂素對AChE酶活幾乎沒有抑制作用,同時連翹酯苷A含量相近,所以Q3和Q2對AChE酶活的抑制作用相似。Q4的主要成分比Q2多了連翹苷和連翹脂素,但連翹酯苷A含量急劇降低,同時蘆丁幾乎不存在于Q4,而蘆丁對AChE酶活也有較強抑制作用,所以Q4相比Q2對AChE酶活的抑制作用大幅降低。由此推測,連翹酯苷A是抑制AChE酶活的主要成分之一。

2.3 剩余物和混合物抑制AChE酶活研究

圖3是Q2,敲除的連翹酯苷A和剩余物的液相分析圖。Q2中,保留時間在28.6 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A;敲除的連翹酯苷A的液相分析圖中,保留時間在28.8 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A,峰面積占比是100%,說明敲除部分完全是連翹酯苷A;剩余物的液相分析圖中,保留時間在29 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A,峰面積是43.32,峰面積占比是0.92%,因此可以判斷出,Q2中的連翹酯苷A基本敲除完全。

A:Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside; D:Forsythiaside; E: Rutin.Fig.3 Liquid phase diagrams of Q2, the knockout forsythiaside and remainderA:連翹酯苷I; B:連翹酯苷B; C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷; D:連翹酯苷A; E:蘆丁圖3 Q2部分,敲除的連翹酯苷A部分和剩余物部分的液相圖

圖4是連翹酯苷A標品的標準曲線圖,根據(jù)標曲圖計算出Q2和剩余物中連翹酯苷A濃度分別為0.26和0.007 mg/mL。為了驗證連翹酯苷A是Q2中抑制AChE酶活的一種主要成分,根據(jù)Q2中連翹酯苷A與剩余物部分的占比,配制混合物,比較Q2、剩余物部分和混合物對AChE酶活的抑制作用。結(jié)果(圖5)表明,隨著濃度(0.2～1.2 mg/mL)的增大,剩余物和混合物對AChE的抑制作用都呈現(xiàn)增強的趨勢。但和Q2相比,因為蘆丁的存在,所以剩余物對AChE的抑制作用(IC50值為(0.52 ± 0.002) mg/mL)只有部分降低;而混合物中由于連翹酯苷A的重新加入,其對AChE的抑制(IC50值為(0.44 ± 0.003) mg/mL)作用與Q2的作用相當。推測出現(xiàn)這種情況的原因可能為將連翹酯苷A敲除后剩余成分由于協(xié)同作用,對AChE仍有抑制作用。又由于連翹酯苷A具有抑制AChE活性,所以混合物的抑酶活性略強于敲除后剩余部分。所以,最終確定連翹酯苷A是Q2中的一種有效作用成分。

Fig.4 Standard curve of forsythiaside.圖4 連翹酯苷A標準品的標準曲線圖

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.5 Inhibitory effects of remainder (A) and mixture (B) on AChE.數(shù)據(jù)表示為means ± SEM(n=3)圖5 剩余物(A)和混合物(B)對AChE的抑制作用

3 結(jié)論

本文主要利用Ellman法系統(tǒng)地考察青翹的不同濃度乙醇洗脫物(Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6)以及主要成分(連翹酯苷A,蘆丁,連翹苷和連翹脂素)對AChE的抑制作用。結(jié)果表明,Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6對AChE的抑制作用研究中,Q2抑酶活性較高;青翹主要成分對AChE的抑制作用相比,連翹酯苷A對AChE的抑制作用強于蘆丁,而連翹脂素和連翹苷對AChE的幾乎沒有抑制作用;結(jié)合液相圖(Q2中連翹酯苷A的峰面積占比較大),我們推測連翹酯苷A在其中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)敲除實驗,證實連翹酯苷A是青翹中的一種有效作用成分。