周 偉，庾國楨，劉亞敏，涂 淮，沈 強(qiáng)?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510405；2.東莞市中醫(yī)院，廣東 東莞523106；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510006）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，阿爾茨海默病的標(biāo)志性病理特征是腦部組織的老年斑中有大量的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積，Aβ 沉積引起的神經(jīng)毒性在阿爾茨海默病的發(fā)病中起著重要作用［1］。Aβ25-35是Aβ 引起神經(jīng)毒性的主要種類之一，可引起大鼠的記憶力下降和腦內(nèi)炎癥的產(chǎn)生，研究表明由Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α 引起神經(jīng)元凋亡，與阿爾茨海默病的發(fā)病具有密切的關(guān)系［2］。而研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者的腦內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)了大量的凋亡，神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致阿爾茨海默病病人神經(jīng)元丟失的主要機(jī)制，減少神經(jīng)元凋亡可能成為治療阿爾茨海默病新的方法［3-4］。另外，NF-κB 參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生物過程，證據(jù)表明Aβ25-35可以激活NF-κB，并且在阿爾茨海默病患者的腦部組織老年斑塊附近的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核中檢測到活化的NF-κB［5］。NF-κB 與IκBα 以無活性形式相互結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，一旦被特定因素，如Aβ25-35刺激，IκBα 將被磷酸化并降解，從而引起NF-κB 激活，并導(dǎo)致IL-1β、TNF-α 等炎癥因子過度分泌，造成神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能減退，促進(jìn)阿爾茨海默病病程的進(jìn)展［6］。臨床研究表明，阿爾茨海默病患者的腦部組織具有慢性炎性反應(yīng)的特征，而且在阿爾茨海默病患者的腦部組織內(nèi)存在過量的炎性因子如IL-1β和TNF-α 等［7-8］，另有研究表明使用非甾體抗炎藥的中年男性的患阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，而且可以延緩阿爾茨海默病患者的病程［9］。因此，通過抑制Aβ25-35激活的IκBα／NF-κB 通路減少炎癥性毒性引起的神經(jīng)元凋亡可能為治療阿爾茨海默病為提供了新的途徑。

黃芩苷是黃芩中有效的黃酮類化合物之一，已被廣泛用于治療各種炎癥性疾病，研究表明黃芩苷通過抗炎作用發(fā)揮抗凋亡，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，說明黃芩苷有可能成為阿爾茨海默病的新治療藥物［10］。研究證實(shí)黃芩苷可穿透血腦屏障分散于腦部組織，更多的聚集在海馬、皮質(zhì)和丘腦等部位，并且能改善癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)能力及認(rèn)知功能［11］。但黃芩苷是否能通過IκBα／NF-κB 通路減少Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡未見明確報(bào)導(dǎo)。本研究以HT22細(xì)胞作為細(xì)胞模型，HT22細(xì)胞是永生化小鼠海馬細(xì)胞系，與分化后的原代海馬神經(jīng)元功能相似。多奈哌齊在臨床上被用于治療阿爾茨海默病，具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用，為本研究的陽性對(duì)照藥物［12］。

1 材料

1.1 試藥 鹽酸多奈哌齊（含有量≥99%）（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B25489）；黃芩苷（含有量≥98%）（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S30647）；DMEM、FBS、胰蛋白酶（美 國 Gibco 公 司，批號(hào)分別為C11996500BT、SLF10270106500、25200072）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（上海貝博生物公司，批號(hào)分別為BB31211、BB3401）；Annexin V-FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（中國聯(lián)科生物公司，批號(hào)70AP101100）；PBS 緩沖液（中國博士德公司，批號(hào)AR0192）；Aβ25-35、MTT、DMSO（美國Sigma 公司，批號(hào)分別為R003143、M5655、D2650）；鹽酸多奈哌齊、β-actin、p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)分別為4967S、2859、13346、12703、11948）。

1.2 儀器 QQ-80 A-II CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海啟前電子科技有限公司）；BBS-SDC 超凈工作臺(tái)（上海博科集團(tuán)）；FC500流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）；CKX31／41／IX51奧林巴斯倒置顯微成像系統(tǒng)（北京儀器儀表有限公司）；Image Quant LAS 4000成像系統(tǒng)（美國GE Healthcare公司）。

1.3 細(xì)胞株 HT22細(xì)胞由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，HT22細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FBS 的DMEM 中，于含有5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中生長，細(xì)胞2～3 d 傳代1次。

2 方法

2.1 藥物制備 使用雙蒸水中制備Aβ25-35（200 μmol／L）的貯備溶液，并在37 ℃下孵育1周誘導(dǎo)肽聚集后避光儲(chǔ)存在-20 ℃；使用雙蒸水制備多奈哌齊（10 mmol／L）儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存于常溫；使用DMSO 制備黃芩苷（1 mmol／L）貯備溶液，避光儲(chǔ)存在-4 ℃。

2.2 分組、給藥 HT22細(xì)胞分為空白組、模型組、黃芩苷組、多奈哌齊組?？瞻捉M在含有10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；模型組加入Aβ25-35（40 μmol／L）培養(yǎng)24 h［13］；按照文獻(xiàn)提示，黃芩苷組加入黃芩苷（50 μmol／L）預(yù)處理1 h 后，加入Aβ25-35（40 μmol／L）共同作用24 h［10］；多奈哌齊組加入多奈哌齊（20 μmol／L）預(yù)處理1 h 后，加入Aβ25-35（40 μmol／L）共同培養(yǎng)24 h［12］。

2.3 MTT 測定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 通過MTT 法測定黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞增值率的影響。將HT22細(xì)胞以2.5×103／孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)，按照上述細(xì)胞分組與藥物處理細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，各個(gè)細(xì)胞孔加入20 μL 的MTT（5 mg／mL），繼續(xù)溫育4 h，用150 μL 的DMSO 替換每孔含MTT 的培養(yǎng)基，并在搖床上震蕩10 min。在酶標(biāo)儀490 nm 處讀取OD 值，細(xì)胞存活率=（OD實(shí)驗(yàn)組／OD空白組）×100%。并在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量的變化。

2.4 Annexin V-FITF／PI 檢測 通過流式細(xì)胞術(shù)測定黃芩苷拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的效果。將HT22細(xì)胞以8×104／孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞過夜貼壁后，按照上述細(xì)胞分組與藥物處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后收獲細(xì)胞，按照試劑盒說明書以1×106個(gè)細(xì)胞的密度重懸于500 μL 的5×Binding Buffer 緩沖液，每管加入5 μL Annexin V-FITC 或10 μL PI，避光孵育5 min，用Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡率。

2.5 Western blot 分析黃芩苷對(duì)IκBα／NF-κB 通路及其下游炎性因子的影響。將HT22細(xì)胞以10×104／孔的密度接種于6孔板。細(xì)胞過夜貼壁后，按照上述細(xì)胞分組與藥物處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞3次后用含有1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞30 min，使用BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)各組蛋白進(jìn)行分離，隨后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，并在室溫下用5%BSA 封閉1 h。將聚偏二氟乙烯膜與一抗于4 ℃溫育過夜（β-actin，1 ∶2 000；p-IκBα，1 ∶2 000；p-NF-κB，1 ∶500；IL-1β，1 ∶1 000；TNF-α，1 ∶4 000）。次日將聚偏二氟乙烯膜與二抗（1 ∶2 000）孵育1 h。最后使用Image Quant LAS 4000成像系統(tǒng)使蛋白條帶顯像，并獲得灰度值，蛋白相對(duì)灰度值=實(shí)驗(yàn)組灰度值／空白組灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞形態(tài)的影響 與空白組比較，模型組的細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞間的間隙增大，細(xì)胞形態(tài)被破壞，細(xì)胞碎片較多；與模型組比較，黃芩苷組與多奈哌齊組的細(xì)胞密度明顯增高，細(xì)胞間的間隙較小，細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞碎片較少；黃芩苷組細(xì)胞密度較多奈哌齊組的稍高、細(xì)胞間隙比較小、細(xì)胞形態(tài)較完整，見圖1。

3.2 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率的影響 見表1。與空白組比較，模型組的細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷組和多奈哌齊組的細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.01）；與黃芩苷組比較，多奈哌齊組的細(xì)胞存活率較低（P＜0.01），說明50 μmol／L 的黃芩苷作用24 h 可拮抗Aβ25-35引起的細(xì)胞毒性。

3.3 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響 與空白組比較，Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡聚集在右下象限為早期凋亡，模型組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷組與多奈哌齊組的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與黃芩苷組比較，多奈哌齊組的細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05）。說明黃芩苷通過抗凋亡作用，起到拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的作用。見圖2、表2。

圖1 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞形態(tài)的影響（×40）

表1 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率的影響（， n=6）

表1 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率的影響（， n=6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與黃芩苷組比較，▲▲P＜0.01

圖2 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響

表2 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡率的影響

3.4 黃芩苷對(duì)IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子的影響與空白組比較，模型組p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNFα 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷組、多奈哌齊組p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著較低（P＜0.01）；與黃芩苷組比較，多奈哌齊組p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋 白表達(dá) 較高（P＜0.05，P＜0.01）。黃芩苷和多奈哌齊可以通過降低由Aβ25-35激活的IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子TNF-α、IL-1β 的分泌來抑制炎性反應(yīng)。見圖3、表3。

表3 黃芩苷對(duì)IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子的影響

4 討論

阿爾茨海默病是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，給社會(huì)健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。阿爾茨海默病的病理特征表現(xiàn)為局部細(xì)胞和分子的炎癥性改變，例如由Aβ 組成的神經(jīng)炎斑塊，以及由高磷酸化的Tau 蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，但阿爾茨海默病的更重要的觸發(fā)因素是異常折疊的Aβ 的毒性積累，主要由小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ清除受損引起，這種清除Aβ 斑塊的失敗誘發(fā)了神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性反應(yīng)，對(duì)阿爾茨海默病的病程進(jìn)展具有重要的促進(jìn)作用［14］。Aβ25-35是Aβ 的一種具有神經(jīng)毒性的亞型，與本研究結(jié)果相一致的是，Aβ25-35作用于HTT22細(xì)胞24 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)明顯受損，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞活力測定進(jìn)一步確定Aβ25-35對(duì)細(xì)胞造成了明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞增值率明顯降低。而通過黃芩苷預(yù)處理后，細(xì)胞的形態(tài)得到了明顯的改善，細(xì)胞增值率明顯升高，且其保護(hù)細(xì)胞的作用與多奈哌齊相比，更具有優(yōu)勢。說明黃芩苷可拮抗由Aβ25-35引起的細(xì)胞毒性。

細(xì)胞通過壞死與凋亡2種方式死亡，細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡，是1種在正常發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程。阿爾茨海默病是進(jìn)行性的神經(jīng)退變性疾病，而海馬神經(jīng)元突觸的改變和海馬神經(jīng)元的凋亡直接導(dǎo)致患者記憶下降和認(rèn)知障礙，且有證據(jù)表明阿爾茨海默病患者的腦部組織發(fā)現(xiàn)了過量的凋亡的神經(jīng)元，提示阿爾茨海默病患者可能是通過細(xì)胞凋亡的方式丟失神經(jīng)元，從而引起認(rèn)知功能減退，另外，Aβ25-35刺激產(chǎn)生的炎性反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說明通過干預(yù)Aβ25-35引起的神經(jīng)元凋亡有助于改善阿爾茨海默病的病程［3-4，15］。本研究表明，Aβ25-35可引起HT22細(xì)胞的早期凋亡，這可能是Aβ25-35引起細(xì)胞增值率降低的方式。而黃芩苷可明顯降低細(xì)胞的凋亡率，從而發(fā)揮拮抗Aβ25-35的細(xì)胞毒性，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，且黃芩苷抗凋亡的效果較多奈哌齊強(qiáng)。

慢性的神經(jīng)炎癥是促進(jìn)神經(jīng)衰老變性和促進(jìn)凋亡的最重要機(jī)制，減輕神經(jīng)炎癥可能成為預(yù)防和治療阿爾茨海默病的策略。NF-κB 是1種關(guān)鍵的與炎癥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)下游炎癥相關(guān)因子來促進(jìn)炎癥發(fā)展和進(jìn)展，NFκB 由哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的5個(gè)家族成員組成，包括p50、p52、p65、c-Rel 和RelB，其中最常見的NF-κB 形式是p65和p50的異二聚體［16］。研究表明，在Aβ 沉積的神經(jīng)元和退行性的神經(jīng)元檢測到高活性的NF-κB 和IκBα，在Aβ 中的神經(jīng)元中斑塊周圍地區(qū)也可檢測到較高水平的NF-κB 和IκBα，且NF-κB 的過度表達(dá)可刺激Aβ 過度沉積，這都說明NF-κB 的激活和過表達(dá)都對(duì)阿爾茨海默病的病程的進(jìn)展具有重要的作用［17］。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，p65和p50的異二聚體通常以與IκBα 以相對(duì)靜止的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中，一旦IκBα 響應(yīng)一些特定的刺激而被磷酸化，NF-κB 將被激活，從而開始靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生炎性因子IL-1β、TNF-α 等［18］。已經(jīng)證明過表達(dá)IL-1β、TNF-α 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出認(rèn)知障礙，而抑制IκBα／NF-κB 通路的激活從而減少IL-1β、TNF-α 等炎性因子的分泌可改善阿爾茨海默病模型鼠的認(rèn)知障礙，且阿爾茨海默病患者中IL-1β、TNF-α 的水平高于正常人，而且IL-1β、TNF-α 都可以刺激Aβ 的產(chǎn)生［18-19］。研究證實(shí)Aβ25-35誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸損失，此外，炎癥反應(yīng)加速Aβ 的沉積，形成惡性循環(huán)，加速阿爾茨海默病的進(jìn)展［20］。在本研究中，我們證明了Aβ25-35刺激HT22細(xì)胞后，促進(jìn)了IκBα 與NF-κB 的磷酸化，刺激了IL-1β、TNF-α 的過度表達(dá)，表明Aβ25-35可以激活I(lǐng)κBα／ NF-κB 通路，引起下游炎癥因子IL-1β、TNF-α 的產(chǎn)生，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)，引起了細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖率的下降。而黃芩苷可以抑制IκBα 與NF-κB的磷酸化，和抑制IL-1β、TNF-α 的表達(dá)，從而拮抗Aβ25-35引起的炎癥性細(xì)胞毒性，減少了細(xì)胞凋亡，提高了細(xì)胞的增值率，且黃芩苷抑制IκBα／NF-κB 通路的能力優(yōu)于經(jīng)典藥物多奈哌齊。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)癡呆范疇，其病因復(fù)雜，毒損腦絡(luò)的病因病機(jī)逐漸得到重視。腦為清靈之府，當(dāng)氣血津液運(yùn)行失常時(shí)，痰濁、瘀血停于體內(nèi)，相互交阻化毒為害，損傷臟腑經(jīng)絡(luò)，使腦竅壅塞，神機(jī)失用而誘發(fā)阿爾茨海默?。?1］。中醫(yī)病機(jī)中的毒損腦絡(luò)與Aβ25-35誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有著共通之處，黃芩具有清熱解毒的功效，在臨床上被廣泛應(yīng)用，具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，但是黃芩成分繁雜，作用機(jī)制難以明確，所以分析黃芩中的單體成分為開發(fā)新藥物更具有優(yōu)勢［22］。黃芩苷為黃芩最主要的成分之一，研究表明，清開靈的主要成分含有黃芩苷，清開靈可改善阿爾茨海默病模型鼠的認(rèn)知障礙，且研究亦證實(shí)單用黃芩苷可改善可抑制阿爾茨海默病模型大鼠的認(rèn)知功能障礙，還可拮抗Aβ1-42的細(xì)胞毒性，提高SHSY5Y 細(xì)胞的生存率［22-23］。黃芩苷還可誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化和抑制環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，說明黃芩苷的神經(jīng)保護(hù)作用越來越得到重視［24］。本研究表明黃芩苷通過抑制HT22細(xì)胞中IκBα／ NF-κB 通路，減少IL-1β、TNF-α的分泌，從而減少Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增值率升高，且黃芩苷保護(hù)細(xì)胞的作用優(yōu)于多奈哌齊。Aβ25-35誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)越來越成為影響神經(jīng)元損傷的1個(gè)因素，進(jìn)一步探討黃芩苷的保護(hù)作用機(jī)制可能會(huì)為治療阿爾茨海默病尋找到新的藥物。