孫 陽，陶雪蓮，解 穎，孫許濤，姜德友

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040）

原發(fā)性肝癌屬于祖國醫(yī)學(xué)中“癥瘕積聚”“肝積”“臌脹”“黃疸”等范疇。該病多為情志抑郁、氣機(jī)不暢、氣滯血瘀、血行受阻，日積月累而成積聚。另外，邪毒外侵、濕熱郁蒸或嗜酒過度，熱毒內(nèi)蘊(yùn)等因素也認(rèn)為是誘因［1］。鱉甲煎丸是張仲景所創(chuàng)，由鱉甲、柴胡、厚樸等二十三味藥組成，具有軟堅(jiān)散結(jié)、祛濕化痰、活血化瘀等功效［2-3］。前期在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸對(duì)H22鼠肝癌細(xì)胞具有抑制作用，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞中抗凋亡因子Survivin 和STAT3蛋白表達(dá)下調(diào)［4］。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究鱉甲煎丸含藥血清對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響，進(jìn)而探討鱉甲煎丸治療肝癌的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物 SMMC-7721肝癌細(xì)胞購于博士德生物公司（編號(hào)CX0296）；Wister 大鼠，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書SCXK（黑）2013-012，在常溫實(shí)驗(yàn)設(shè)施環(huán)境中給予無菌飼料和蒸餾水飼養(yǎng)。

1.2 試藥 鱉甲煎丸（國藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020772，批號(hào)150870）；順鉑（美國Sigma 公司，批號(hào)MKBV3446V）；MTT（美國Sigma 公司，批號(hào)M-2128）；AnnexinⅤ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天公司，批 號(hào) C1062）；Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3和GAPDH 一 抗（Abcam 公 司，批號(hào)分別為 ab182858、ab32503、ab68153、ab76315和ab128915）。

1.3 儀器 Aira 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）、Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）、MX3000P 實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國安捷倫科技公司）、DPX-9162B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，敚?、PowerPacTMHC 型電泳儀（美國Agilent 公司）、VE-180型垂直電泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 制備鱉甲煎丸含藥血清 參考鱉甲煎丸臨床用量，根據(jù)轉(zhuǎn)換公式計(jì)算大鼠的劑量，將人日用劑量的15倍鱉甲煎丸用生理鹽水配置成懸溶液。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，正常對(duì)照組給予生理鹽水；鱉甲煎丸組每日給予12 g／kg 鱉甲煎丸懸溶液，分2次給藥，連續(xù)灌胃3 d，第3天第1次給藥后2 h 再次給藥，1 h 后乙醚麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血［5］，靜置2 h 以上，1 500 r／ min 離心15 min，收集血清，將其混合，56 ℃，30 min 滅活，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MTT 法檢測肝癌細(xì)胞增殖 將SMMC-7721細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液接種于96孔板上（密度1×104／mL，每孔200 μL），空白對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液（正常組血清10%，鱉甲煎丸血清0%），實(shí)驗(yàn)組分別加入鱉甲煎丸不同濃度含藥血清（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%），在37 ℃，5% CO2，濕度適宜條件下分別作用24、48 h，將每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，每孔加入100 μL 二甲基亞砜DMSO，振蕩搖勻。波長490 nm，酶標(biāo)儀讀取吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組平均值／A對(duì)照組平均值）×100%，每組設(shè)定5個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算平均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定后期實(shí)驗(yàn)鱉甲煎丸高、中、低劑量組。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡 將密度為5×104／mL SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中。細(xì)胞貼壁生長后，將培養(yǎng)液吸棄，加入鱉甲煎丸低、中、高劑量（5%、10%、15%）含藥血清和陽性對(duì)照藥順鉑（順鉑加入完全培養(yǎng)液，10 μg／mL 順鉑）作用細(xì)胞24 h，PBS 緩沖液沖洗，胰酶消化后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取50 000重懸的細(xì)胞，1 000 g／min離心5 min，棄上清，加入195 μL AnnexinV-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻。加入10 μL PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，應(yīng)用FACSDiva Version6.1軟件對(duì)凋亡率進(jìn)行分析。結(jié)果見圖1。

2.4 qRT-PCR 法檢測肝癌細(xì)胞Bcl-2、BAX、STAT3 mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，細(xì)胞總RNA 用Trizol 法提取，瓊脂糖凝膠電泳法分析RNA 的完整度，分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。在無菌離心管中配置反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)方法及條件同文獻(xiàn)［6］。依據(jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫，查找BAX、Bcl-2、STAT3、GAPDHmRNA 的全基因序列，引物由上海艾博思生物科技有限公司協(xié)助合成。引物序列為GAPDH（113 bp）正向5’ -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，反 向 5’ -AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；Bcl-2（89 bp）正向5’ -CCCTGTGGATGACTGAGTACCTG-3’，反向5’ -GCCGTACAGTTCCACAAAGGC-3’；BAX（150 bp）正向 5 ’ -CCCTTTTCTACTTTGCCAGCA-3 ’，反 向 5 ’ -GGAGTCTCACCCAACCACCC-3’；STAT3（148 bp）正 向5’ -CAGCAGCTTGACACACGGTA-3’，反 向 5’ -ACACCAAAGTGGCATGTGA-3’。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃，30 s，62 ℃，40 s，循環(huán)40次。每組3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)水平。

2.5 Western blot 法檢測肝癌細(xì)胞Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 收集經(jīng)5%、10%、15%鱉甲煎丸含藥血清和順鉑（10 μg／mL）作用24 h 的SMMC-7721細(xì)胞，PBS洗滌后加入蛋白裂解液作用1 h，收集上清，測定各組蛋白濃度。取蛋白20 μg 加入上樣緩沖液，95 ℃條件下變性10 min。經(jīng)過凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入稀釋的一抗（Bcl-2、BAX、STAT3、p-STAT3，1 ∶1 000；GAPDH 1 ∶10 000），4 ℃孵育過夜，漂洗后加入標(biāo)記后的二抗（1 ∶5 000）孵育后顯影檢測，應(yīng)用Gel-Pro Analyzer 軟件分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 如表1所示，隨著鱉甲煎丸含藥血清濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率增加，呈濃度依賴性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5%、10%、15%鱉甲煎丸含藥血清。

表1 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響（， n=6）

表1 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響（， n=6）

注：與空白對(duì)照組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

3.2 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響 如表2所示，鱉甲煎丸含藥血清作用肝癌細(xì)胞24 h 后，早期凋亡率、晚期凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組，總凋亡率顯著升高（P＜0.01），并具有濃度依賴 性。陽性對(duì)照組（10 μg／mL順鉑）細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡率均高于鱉甲煎丸組，且總凋亡率最高（P＜0.01）。

表2 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響（%，， n=3）

表2 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響（%，， n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，＃＃P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較，??P＜0.01

圖1 鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

3.3 鱉甲煎丸 對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2、BAX、STAT3 mRNA 表達(dá)的影響 如表3所示，藥物作用SMMC-7721細(xì)胞24 h 后，與空白對(duì)照組比較，除5%含藥血清鱉甲煎丸組Bcl-2、BAXmRNA 外，鱉甲煎丸組、陽性對(duì)照組能顯著抑制Bcl-2、STATS3 mRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），促進(jìn)BAXmRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。陽性對(duì)照組Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著低于鱉甲煎丸組（P＜0.01），但STAT3 mRNA 表達(dá)明顯高于鱉甲煎丸組（10%、15% 含藥血清）（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2、 BAX、 STAT3 mRNA 表達(dá)的影響（， n=3）

表3 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2、 BAX、 STAT3 mRNA 表達(dá)的影響（， n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3.4 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞BAX、Bcl-2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，藥物作用SMMC-7721細(xì)胞24 h 后，與空白對(duì)照組比較，鱉甲煎丸組、陽性對(duì)照組能顯著抑制Bcl-2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），BAX／Bcl-2比值顯著升高（P＜0.01）。

圖2 鱉甲煎丸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2、BAX、STAT3和p-STAT3蛋白的影響（n=3）

4 討論

天然藥物抗腫瘤的機(jī)制主要有抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低放化療的副作用及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等［7-10］。鱉甲煎丸是臨床經(jīng)驗(yàn)方劑，有廣泛的開發(fā)前景，尤其在抗腫瘤方面的研究具有重要意義。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸對(duì)肝星狀細(xì)胞、HepG2、H22肝癌細(xì)胞均有抑制作用［11-14］，但對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸含藥血清誘導(dǎo)了SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2 mRNA 表達(dá)，上調(diào)BAXmRNA 表達(dá)，BAX 蛋白表達(dá)上調(diào)雖不顯著，但鱉甲煎丸明顯增加了BAX／Bcl-2，具有濃度依賴性。Bcl-2和BAX 都是Bcl-2家族成員。Bcl-2家族是作用于線粒體的細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。Bcl-2抑制凋亡［15］，BAX 促進(jìn)凋亡［16］，它們調(diào)節(jié)膜通道的開放和促凋亡物質(zhì)的流動(dòng)，這是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。通過本實(shí)驗(yàn)推測，鱉甲煎丸誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是激活了線粒體凋亡途徑。Bcl-2上游基因有STAT3基因［17-18］，JAK／STAT 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)［19-20］。在炎癥相關(guān)的肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子STAT3高度活化，p-STAT3可與下游核內(nèi)特異的DNA 結(jié)合，直接或間接地上調(diào)抑制凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡［21-23］。鱉甲煎丸含藥血清抑制了SMMC-7721細(xì)胞STAT3基因表達(dá)，其下游基因Bcl-2表達(dá)也同時(shí)下調(diào)，可能藥物抑制了JAK／STAT 信號(hào)通路，發(fā)揮誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞線粒體途徑凋亡。本課題組前期在體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸通過抑制STAT 信號(hào)通路誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞凋亡［4］。今后我們將繼續(xù)研究鱉甲煎丸抗腫瘤的其他可能機(jī)制。